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肺癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居所有惡性腫瘤之首。其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞增殖與凋亡的失衡，即增殖過度或凋亡不足。誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖已成為肺癌輔助治療的新策略。本研究對37例中晚期肺癌患者采用術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療，觀察凋亡調(diào)控基因p53表達(dá)、癌細(xì)胞凋亡的情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 83例患者均來自2006年7月至2009年6月在我科治療的患者。診斷及入組標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前有胸部X線片及CT等的臨床診斷，經(jīng)纖維支氣管鏡檢查并活檢(包括刷片)所得的病理診斷。術(shù)后均有切除標(biāo)本的最后病理學(xué)診斷。術(shù)后的TNM分期采用2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM分期修訂標(biāo)準(zhǔn)。中晚期非小細(xì)胞肺癌的確定標(biāo)準(zhǔn)為ⅢA期和ⅢB期肺癌，以及ⅡB期肺癌手術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)肺門淋巴結(jié)融合固定而不能徹底清掃，又無條件行全肺切除，達(dá)不到根治性手術(shù)要求者。分為3組:術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療組(A組)37例，年齡45～70歲，行根治性肺癌切除31例，未達(dá)到根治手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)共6例。術(shù)前灌注化療組(B組)31例，年齡45～70歲，術(shù)前行灌注化療，行根治性肺癌切除26例，未達(dá)到根治手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)共5例。直接手術(shù)組(C組)15例，年齡45～65歲，僅行根治性肺癌切除14例，未達(dá)到根治手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)共1例。3組之間患者年齡、性別、分期、分型等無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 介入灌注化療操作:A、B組術(shù)前1周均先經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管至支氣管動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈或肋間動(dòng)脈造影，根據(jù)造影結(jié)果將導(dǎo)管超選擇性插入腫瘤供血?jiǎng)用}，注入化療藥物順鉑和絲裂霉素。根據(jù)患者一般情況及體表面積決定用藥量，一般順鉑80～100 mg，絲裂霉素14～20 mg。

1.2.2 熱療:使用珠海市和佳醫(yī)療設(shè)備有限公司HG-2000體外高頻熱療機(jī)，頻率為13.56 MHz，上下電極直徑均為17 cm，電壓200 V，功率3000 W，治療時(shí)間60 min/次，測溫系統(tǒng)由測溫傳感器和計(jì)算機(jī)組成，深度可達(dá)17～25 cm，溫度控制在41～44℃，機(jī)控輸出功率90% ～95%(計(jì)算機(jī)控制并與溫度相關(guān)，如大于此數(shù)值則溫度達(dá)44℃，如小于此數(shù)值則溫度＜41℃)。術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療組行介入灌注化療前1 h，用HG-2000體外高頻熱療機(jī)治療1次，溫度控制在41～44℃，注藥24 h后再次熱療1次，治療時(shí)間60 min/次。

1.2.3 主要試劑:即用型鼠抗人 p53、bcl-2、PCNA單克隆抗體及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。該試劑盒包括:即用型過氧化酶阻斷劑(試劑A)，即用型阻斷血清，10%非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，即用型生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，即用型鏈霉菌素蛋白-過氧化酶溶液(試劑D)。

1.2.4 標(biāo)本的收集和制片方法:A、B組所有病例于治療前經(jīng)細(xì)針穿刺取材，手術(shù)中留取腫瘤組織標(biāo)本。所取標(biāo)本常規(guī)甲醛溶液固定，后脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟包埋，將每一癌組織蠟塊切片4張，厚為4 μm，1張常規(guī)HE染色，另3張采用鏈霉菌抗生物素過氧化物酶(streptavidin peroxidase conjugated methods，S-P)免疫組化法分別檢測癌組織中PCNA、bcl-2、p53蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算:高倍鏡下(×400倍)分別觀察治療前后癌組織HE染色片10個(gè)視野，根據(jù)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征識別凋亡細(xì)胞，其特征如下:(1)單個(gè)萎縮細(xì)胞，周圍有空暈;(2)核固縮;(3)濃縮的嗜酸性細(xì)胞質(zhì);(4)凋亡小體形成［1］。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 增殖指數(shù)(PI)的計(jì)算和bcl-2、p53染色結(jié)果的判斷:PCNA和p53為細(xì)胞核內(nèi)著色，bcl-2為核膜和細(xì)胞質(zhì)著色，光鏡下呈現(xiàn)黃到棕褐色為陽性。選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算PCNA陽性細(xì)胞數(shù)所占比例作為PI，即PI=PCNA陽性細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù)×100%，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。bcl-2和p53染色結(jié)果規(guī)定:陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，或背景同空白對照時(shí)為(-);10%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為(+);25% ＜陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為(++);陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包作統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用配對t檢驗(yàn)和方差分析，等級資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A、B、C組手術(shù)前后癌細(xì)胞的AI、PI間的比較 3組治療前癌細(xì)胞的AI、PI差異無顯著性意義。A、B組病例治療后AI高于治療前，治療后PI低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);A組與B組的AI均高于C組，A組的AI又高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01);A組與B組的PI均低于C組，A組的PI又低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。見表2。

表2 3組手術(shù)前后癌細(xì)胞的AI、PI間的比較(±s)

表2 3組手術(shù)前后癌細(xì)胞的AI、PI間的比較(±s)

注:與治療前比較，＊＊P＜0.01;與 C組比較，△△P＜0.01;與 B組比較，##P＜0.01

2.2 3組手術(shù)前后bcl-2、p53表達(dá)的變化 A組、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，手術(shù)后癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);A組術(shù)后癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);A組、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)較C組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表3 3組手術(shù)前后bcl-2、p53表達(dá)的變化(n)

3 討論

熱療是臨床腫瘤治療的一種重要手段，通過加熱腫瘤使其局部溫度升高達(dá)到41℃左右。腫瘤組織含水率高，組織內(nèi)血液循環(huán)不良，因而散熱性差，其溫度升高比周圍正常組織更明顯，一般高出5℃左右，加之腫瘤細(xì)胞耐熱性差，當(dāng)溫度升高至41℃時(shí)即可被殺死，而健康組織卻可耐受45℃的高溫，因此可以利用微波加熱來治療腫瘤［1］。熱療可以加強(qiáng)和協(xié)同化療藥物發(fā)揮作用，熱療與化療聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的增效互補(bǔ)和減少并發(fā)癥的作用［2］。

細(xì)胞凋亡是一種由內(nèi)源性多基因控制的、主動(dòng)的程序化細(xì)胞死亡過程，這種死亡方式可以與具有自我更新能力的組織通過有絲分裂不斷產(chǎn)生新細(xì)胞相平衡，因而對正常組織維持穩(wěn)定具有重要作用。腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展取決于凋亡、增殖兩方面的因素，細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤形成的原因之一。近年來大量研究表明，熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是熱療殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制［3］，在敏感組織中，加熱至42℃，30 min可以引起廣泛的細(xì)胞凋亡，而加熱到46℃或更高則產(chǎn)生壞死，且不同腫瘤對高溫反應(yīng)差別很大［4］。

抗癌藥物具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的作用，動(dòng)脈灌注化療已成為晚期肺癌的綜合治療措施。熱療技術(shù)作為惡性腫瘤新的治療手段，安全性高，無明顯的不良反應(yīng)［5］，能夠在有效的溫度范圍內(nèi)提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥［6］，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。同時(shí)熱療可致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化，促進(jìn)化療藥物誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，與動(dòng)脈灌注化療有明顯的協(xié)同作用。

研究表明，熱療和化療聯(lián)合對 A549細(xì)胞生長的抑制作用強(qiáng)于單純熱療和單純化療［8］，多集中在體外試驗(yàn)，而較少臨床研究。本研究采取術(shù)前行熱療聯(lián)合灌注化療，取術(shù)前及術(shù)后病理組織進(jìn)行研究，結(jié)果表明，術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療和術(shù)前灌注化療組術(shù)后癌組織的AI明顯升高，提示治療肺癌的臨床療效部分是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的，術(shù)前熱療組的AI明顯高于灌注組，提示熱療參與腫瘤細(xì)胞的凋亡，且與化療實(shí)現(xiàn)了協(xié)同作用。

隨著現(xiàn)代腫瘤熱療技術(shù)的發(fā)展，許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)熱療是一種非常理想的輔助治療手段，熱療可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并通過誘導(dǎo)p53的表達(dá)、下調(diào)凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)以利于細(xì)胞進(jìn)入凋亡。

本研究采用術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療，充分發(fā)揮熱療與化療抗腫瘤的協(xié)同作用，旨在探討術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療對中晚期肺癌患者癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響。由于AI、PI是評價(jià)腫瘤細(xì)胞凋亡程度和增殖活性的最常用的指標(biāo)，治療后癌細(xì)胞AI、PI的變化亦可作為判斷治療敏感性和療效的標(biāo)準(zhǔn)［9］，因此我們研究提示:術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療能使肺癌癌細(xì)胞凋亡增加，增殖下降，是較理想的綜合治療方法之一。

bcl-2作為凋亡抑制基因，其蛋白產(chǎn)物可保護(hù)多種細(xì)胞免于各種誘因所致的細(xì)胞凋亡。p53是一種抑癌基因，在肺癌中突變頻率較高。正常的p53基因?yàn)橐吧?，發(fā)生突變者則稱為突變型。野生型p53抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而突變型p53功能與之相反，并可抑制野生型p53的抑癌活性，p53遂由抑癌基因轉(zhuǎn)為原癌基因。我們研究發(fā)現(xiàn)，A、B組治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)較C組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明bcl-2、p53陽性表達(dá)水平與肺癌的分期有關(guān)，和先前的研究一致。A、B組病例治療前癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組、B組術(shù)后癌組織bcl-2、p53陽性表達(dá)低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明術(shù)前熱療聯(lián)合灌注化療能發(fā)揮抗腫瘤的協(xié)同作用，明顯下調(diào)bcl-2和p53的陽性表達(dá)，從而使AI升高、PI下降。

［1］Sagowaki C，Jaehne M，Kehrl W，et al.Tumor oxygenenation undercombined whole-body-hyperthermia and polychemotherapy in a case of recurrent carcinoma of the oral cavity［J］.Eur Arch Ororhinolaryngol，2002，259(1):27-30.

［2］徐剛，王遠(yuǎn)東.全身熱化療的作用機(jī)理［J］.人民軍醫(yī)，2002，45(11):637-639.

［3］Rong Y，Mack P.Apoptosis induced by hyperthermia in Dunn osteosarcoma cell line in vitro［J］.Int J Hyperthermia，2000，16(1):19.

［4］Choi EK，Park SR，Lee JH，et al.Induction of apoptosis by carboplatin and hyperthermia alone or combined in WERI human retinoblastoma cells［J］.Int Hyperthermia，2003，19(4):431-443.

［5］蔚伯，谷銑之.腫瘤放射治療學(xué)［M］.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2002:437-447.

［6］王琳，楊繼要，吳逸明.熱化療對肺部腫瘤細(xì)胞生長影響的研究［J］. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2007，24(2):201-203.

［7］Wang JH，Yao MZ，Zhang ZL，et al.HSF1 blockade-induced tumor thermotolerance abolishment is mediated by JNK-dependent Caspase-3 activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，321(3):736-745.

［8］高姍，王琳，吳衛(wèi)東，等.熱化療對肺癌 A549細(xì)胞HSP70、JNK及p-JNK蛋白表達(dá)的影響［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(5):529-532.

［9］Adell G，Zhang H，Jansson A，et al.Decreased tumor cell proliferation as an indicator of the effect of preoperative radiotherapy of rectal cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，50(3):659-663.