Jeffrey J.Zimmerman（美國衣阿華州立大學(xué) 教授）

利用口腔液對豬群健康進行管理

Jeffrey J.Zimmerman（美國衣阿華州立大學(xué) 教授）

人類使用自己的口腔液進行疾病診斷和健康評估已經(jīng)有很長的歷史，并且奠定了非常深厚的研究基礎(chǔ)。如通過檢測口腔液中的抗百日咳病毒IgG來診斷和監(jiān)控兒童或青少年感染百日咳的情況，還有人采用PCR方法對口腔液中的人皰疹病毒6型進行定量分析，可見口腔液檢測在人醫(yī)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。而艾滋病家用試劑盒的出現(xiàn)表明這套系統(tǒng)在人醫(yī)的應(yīng)用上達到頂峰。

而以采集口腔液為基礎(chǔ)的健康監(jiān)測系統(tǒng)能否用于養(yǎng)豬生產(chǎn)呢？2005年，美國衣阿華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實驗室對豬藍耳病做持續(xù)監(jiān)測研究。這項研究要求每兩周對扁桃體采集一次樣本，顯然連續(xù)200多天地持續(xù)進行扁桃體涂樣是不可能的。無奈之下，通過采集口腔液替代扁桃體涂樣，來檢測抗體并進行PCR試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體檢測和PCR試驗的結(jié)果都是陽性的。接下來的一系列試驗證實，此方法不僅可以做疫病的持續(xù)監(jiān)測，而且不受豬日齡的影響。該獸醫(yī)診斷實驗室2010年共檢測樣本11000份，2011年檢測32517份，2012年預(yù)計能檢測52000份以上。樣本數(shù)的逐年增加說明檢測結(jié)果是有效的。

1 口腔液的采集方法

采集口腔液的主要工具是棉繩，棉繩長約30cm。首先將棉繩掛在豬能接觸到的地方，同時為了保持樣本的清潔，棉繩懸掛的高度應(yīng)以其末端位于豬的肩部為準，最好是豬抬頭才能接觸到的高度。研究表明，在25～30頭豬的欄位里， 75%的豬在20～30分鐘內(nèi)會接觸并咀嚼棉繩，因此完成采樣工作需要20～30分鐘。收集樣本時，將被唾液潤濕的一端棉繩（長約18cm）放入樣本收集袋（如勻漿液過濾袋）中，剩下的部分剪掉。將袋子扎破，擠壓袋子，將擠出的液體放入試管中，存于-20℃冰箱備用。

不同日齡的豬均可使用以上方法采集口腔液。對于年齡較小的豬，可以將棉繩放在地上任其玩耍，讓它們知道棉繩無危險后，再將放在地上的棉繩扔掉，用掛起來的棉繩繼續(xù)采集樣本。除了棉繩，還可用麻繩和尼龍繩采集口腔液。研究表明，三種材料對ELISA的檢測結(jié)果影響不大，但對PCR的檢測結(jié)果影響較大，PCR試驗必須使用棉繩采集口腔液。

2 用PCR方法檢測口腔液中的病原

已有研究表明，PCR方法可以檢測口腔液中的豬瘟病毒、豬圓環(huán)2型病毒 （PCV2）、 豬流感病毒、 藍耳病病毒（PRSSV）等。Weesendorp等（2009年）檢測了豬口腔液中的病毒TCID50（50%致細胞病變當(dāng)量），這些豬感染了豬瘟病毒的不同毒株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒力較強的Brescia株在豬體內(nèi)存在10天左右就會導(dǎo)致豬只死亡，而毒力較弱的Zoelen毒株在豬體內(nèi)存活的時間較長，病毒接種54天后仍可檢測到（圖4）。Prickett等（2011年）利用定量PCR檢測了接種的PCV2病毒在豬唾液中的量和持續(xù)時間。結(jié)果表明，該病毒在接種豬后的第2天即可被檢測到，并且在接種98天后仍然可以檢測到，濃度為1×105.6拷貝/mL。Allerson和 Torremorell（2012年）使用RT-PCR方法比較了生長育肥豬的鼻腔樣中和口腔液中的豬流感病毒情況，試驗16天以內(nèi)能在鼻腔涂樣中檢測到流感病毒，而到試驗第69天都可以在口腔涂樣中檢測到流感病毒 （圖 5）。Kittawornrat等（2010年）將24頭成年公豬分成三組，分別接種PRSSV疫苗、1型PRSSV野毒和2型PRSSV野毒，采用qRT-PCR檢測了口腔液中的PRSSV，發(fā)現(xiàn)接種后21天，所有的口腔液樣品均表現(xiàn)為陽性。

3 口腔液中的抗體檢測

人醫(yī)可利用口腔液進行傳染性疾病的診斷，大部分診斷是基于抗體的檢測。這主要有以下三個原因：一是抗體檢測相對于PCR檢測更廉價；二是通過口腔液檢測抗體的技術(shù)較成熟；三是抗體檢測的重復(fù)性更好。

血清抗體分析的大部分試驗都可以進行簡單的優(yōu)化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛脕頇z測口腔液中抗體的試驗方法，如改變培養(yǎng)時間、試劑的稀釋倍數(shù)、陰性和陽性的閾值設(shè)定等。Prickett等（2011年）用PCV2接種豬，接種后14～98天在豬的口腔液中均檢測到抗PCV2抗體，如IgG、IgM和IgA。口腔液中抗PCV2的IgG和IgA濃度在不同的豬只之間差異不顯著，在接種后14～21天開始檢測到，到試驗結(jié)束時仍能檢測到這兩種抗體（圖6）。而抗PCV2的IgM在不同接種動物的口腔液中濃度差異顯著，接種后14天開始一直到試驗結(jié)束時均能檢測到這個抗體。Panyasing等研究發(fā)現(xiàn)豬接種豬流感病毒后，在接種后7天即可從口腔液中檢測到豬流感病毒的核蛋白抗體，與未接種的豬形成明顯的差異。Kittawornrat（2012年）將檢測抗PRRSV抗體的商業(yè)用ELISA試劑盒進行改造，用于檢測口腔液中的抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工接種PRRSV的試驗豬口腔液中很容易檢測到IgM和IgA，商品場則很難檢測到這兩種抗體，而無論是試驗豬群還是商品場豬群，均很容易檢測到IgG，并且其檢出量達到了診斷水平。若將樣本陽性閾值設(shè)定為≥0.40，利用受試者操作特征進行分析估算，得到該方法的診斷靈敏度和特異性分別為94.7%和100%。但由于監(jiān)測需定期收集樣本，重復(fù)次數(shù)較多，對靈敏度的要求不是很嚴?？梢?，ELISA檢測口腔液中的抗PRRSV IgG可用于監(jiān)測商品豬場的PRRSV流行情況。

4 總結(jié)

在獸醫(yī)臨床上，我們需要對地方病和外來病進行更好的監(jiān)測，以做好疫病的防疫工作。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，使用優(yōu)化的PCR方法可以對口腔液中的很多種病原進行檢測。同樣，基于口腔液的抗體檢測方法也可以逐漸被開發(fā)出來，且使用口腔液監(jiān)測比血清學(xué)監(jiān)測在養(yǎng)豬生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢。