許林平，張瑞芳，馬 臣，樊青霞，買 玲

(1.河南省腫瘤醫(yī)院 河南鄭州 450008;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003;3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南鄭州 450052)

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)在每年肺癌新發(fā)病例約160萬例，占所有癌癥新發(fā)病例的12.7%［1］。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80% ～85%，確診時約2/3的患者為不可切除的晚期患者［2］。鉑類抗癌藥一直是治療非小細(xì)胞肺癌的主要藥物，特別是順鉑類抗癌藥。目前仍以含鉑方案化療作為治療晚期非小細(xì)胞肺癌的主要手段。20世紀(jì)90年代以來，隨著第3代抗癌藥物的出現(xiàn)［健澤(gemcitabine)、諾維本(vinorelbine)、泰素(taxol)、泰索帝 (taxotere)、伊立替康 (CPT-11)］，晚期肺癌病人的治療效果有了一定的提高，非鉑類治療方案也成為一種較好的選擇。如何在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高鉑類藥物使用的針對性，成為臨床研究熱點(diǎn)。金屬硫蛋白(MT)是生物體內(nèi)普遍存在的一類金屬結(jié)合蛋白，人MT基因是包括10個功能性基因和7個非功能性基因的異構(gòu)體，MT1H是其中一個功能性基因。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)含巰基蛋白以MT為主，而腫瘤細(xì)胞耐藥與細(xì)胞解毒體系含巰基蛋白的過量表達(dá)有關(guān)。故MT在腫瘤耐藥中的作用，尤其是順鉑(DDP)耐藥已引起臨床關(guān)注。已發(fā)現(xiàn)MT與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其各種異構(gòu)體的功能尚不完全清楚［3］。我們回顧性分析了2006年5～9月所有入院非小細(xì)胞肺癌病人的MT1H表達(dá)與晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)臨床病理特征及其與病人生存的關(guān)系，試圖篩選出預(yù)測腫瘤耐藥的指標(biāo)，以提高臨床化療的針對性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院2006年5～9月完成含鉑方案(Gemcitabine+DDP或NVB+DDP方案)化療2個完整周期的40例可靠NSCLC的病歷資料(均為喪失手術(shù)時機(jī)或不愿手術(shù)、放療的初治患者，均經(jīng)病理診斷確診)。其中男性25例，女性15例，平均年齡58歲。參照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌(SC)17例，腺癌(AC)23例;高、中分化癌19例，低分化癌21例;按國際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅲa期7例，Ⅲb期16例，IV期17例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無轉(zhuǎn)移者21例。

1.2 治療方法 40例患者均有2個周期完整的含順鉑方案(Gemcitabine+DDP或異長春花堿+DDP方案)治療，化療前及化療第2周期的第5～6周分別抽取外周血，并拍攝胸片或胸部CT。根據(jù)WHO療效標(biāo)準(zhǔn)，完全緩解或部分緩解者為化療有效，穩(wěn)定者或進(jìn)展者為化療無效。40例患者中有39例有完整的隨訪資料，生存期自化療首日至死亡或失訪日止。隨訪48～1 095 d，中位隨訪 264 d，平均隨訪 414.61 d。

1.3 MT-1H 基因檢測

1.3.1 總RNA的提取:采取患者外周靜脈血2 ml加入2%乙二胺四乙酸鹽(1∶9)抗凝，迅速送檢。采用分離試劑提取RNA。紫外分光光度計測定RNA含量和純度。

1.3.2 RT-PCR檢測:用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA，取cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MT1H引物為:P1，5’-CCA GTC TCA CCT CGG CTT G-3’;P2，5’-TAG CAA ATG AGT CGG AGT TGT-3’，擴(kuò)增片段大小為294 bp。βaction(作為內(nèi)參照)引物為:P1，5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT-3’;P2，5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，擴(kuò)增片段為480 bp。擴(kuò)增條件為:94℃2 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán);72℃ 5 min。

1.3.3 結(jié)果判斷:取 5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用含 EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在VDS800凝膠成像系統(tǒng)中半定量分析，每份標(biāo)本均觀察到480 bp位置的β-action特異性擴(kuò)增條帶，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA的完整性以及PCR反應(yīng)成功。MT1H陽性結(jié)果為兩條帶:MT1H為294 bp，β-action為480 bp。以兩條帶之積分光密度比值反映MT1H基因的相對表達(dá)水平。其標(biāo)準(zhǔn)為 MT1H/β-action ≥0.2 為陽性表達(dá)，MT1H/β-action＜0.2時為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。半定量結(jié)果用±s表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后行t檢驗(yàn)和單因素方差分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。生存分析用Ka-plan-meier法和Cox回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 化療前后MT1H表達(dá) 40例患者化療后MT1H表達(dá)(0.53 ±0.23)明顯高于化療前(0.43 ±0.26)，化療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 化療前MT1H表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 化療前MT1H表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤組織學(xué)類型和TNM分期無關(guān)(P＞0.05);AC與腫瘤的分化程度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即MT1H在高、中分化肺癌的陽性表達(dá)比低分化肺癌陽性表達(dá)低，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達(dá)比有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達(dá)低(P均＜0.05)。見表1。

2.3 化療效果與化療前后MT1H表達(dá) 40例中有效21例，無效19例?；熐昂驧T1H表達(dá)在有效組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，無效組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。化療前后MT1H表達(dá)差值在有效組中是(0.04 ±0.31)，無效組中是(0.18 ±0.20)，兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.69，P＞0.05)。見表2。

表1 化療前MT1H表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達(dá)差異比較 (±s)

表2 有效組與無效組化療前后MT1H表達(dá)差異比較 (±s)

注:*表示有效組和無效組化療前后表達(dá)差值比較。

組別 n 化療前 化療后 t P MT-1H表達(dá)差異MT-1H t P有效 21 0.45 ±0.32 0.49 ±0.16 －0.560 0.582 0.04 ±0.31 －1.69 0.10*無效 19 0.41 ±0.19 0.58 ±0.29 －3.905 0.001 0.18 ±0.20

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 見圖1、圖2。

2.5 MT表達(dá)與患者生存的關(guān)系

2.5.1 預(yù)后因素的單因素分析:MT陰性組中位生存期是304 d，陽性組是246 d，提示MT高表達(dá)可能會導(dǎo)致晚期非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后較差，但用Kaplan-meier法進(jìn)行單因素的生存分析得 χ2=1.6，P=0.206，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

2.5.2 Cox 回歸模型多因素分析［4，5］:應(yīng)用 Cox 模型強(qiáng)制進(jìn)入法分析患者的性別、年齡段、病理分型、分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、MT等多個因素對晚期NSCLC生存的影響。結(jié)果顯示年齡段是影響晚期NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素，MT可能是影響晚期NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。見表3。

圖3 MT陽性組與陰性組生存曲線

表3 40例NSCLC患者的COX預(yù)后多因素回歸分析

3 討論

由于NSCLC早期診斷率低，約80%的患者就診時己失去手術(shù)機(jī)會。第3代抗癌藥的聯(lián)合化療有效率僅為30% ～40%，5年生存率不足15%［6］。化療失敗的主要原因是腫瘤對化療藥物的原發(fā)性耐藥及獲得性耐藥。研究顯示，MT與腫瘤耐藥有關(guān)，但在人發(fā)育不同時期或在不同生理?xiàng)l件下不同MT異構(gòu)體功能不同。本文結(jié)果證實(shí)，本研究中40例NSCLC患者，化療后MT1H表達(dá)相對化療前有增高趨勢，提示可能存在化療后的獲得性耐藥。Oguri等［7］認(rèn)為，此與體內(nèi)化療藥物誘導(dǎo)和對異生化合物生理壓力反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MT1H在NSCLC中的表達(dá)與患者的性別、年齡、TNM分期無關(guān)，并且在AC中的表達(dá)強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異，說明組織學(xué)類型與MT1H的表達(dá)無明顯相關(guān)性。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度與MT1H的表達(dá)有相關(guān)性，隨著分化程度的降低MT1H的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能有MT1H的參與。這與乳腺癌和食管癌等腫瘤中MT的表達(dá)報道一致［8］。MT1H在惡性較高的NSCLC中更趨于表達(dá)，表明MT1H很可能是一種反映腫瘤惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)，有可能作為臨床確定治療方案及判斷預(yù)后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的參考依據(jù)。目前關(guān)于MT1H與臨床療效的關(guān)系尚無定論。Wood等［9］研究認(rèn)為，MT表達(dá)與膀胱癌含順鉑方案化療敏感性無關(guān);Kotoh等［10］認(rèn)為，在泌尿系移形細(xì)胞癌中MT表達(dá)水平與含順鉑方案化療敏感性呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示，MT1H表達(dá)與化療效果無明顯相關(guān)性，尚不能預(yù)測化療療效。多數(shù)報道認(rèn)為MT表達(dá)與生存情況為負(fù)相關(guān)的關(guān)系，如用含順鉑方案化療的泌尿系腫瘤，MT蛋白與生存有關(guān)［11］。丁華野等［12］研究認(rèn)為，MT 表達(dá)與乳腺癌生存呈負(fù)相關(guān)，Joseph等［13］認(rèn)為MT表達(dá)與小細(xì)胞肺癌生存呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示MT表達(dá)情況可能與采用含鉑方案化療病人的生存情況呈負(fù)相關(guān)，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與化療對晚期非小細(xì)胞肺癌生存改善有限有關(guān)。此外，患者入院時肺癌的分期情況、后續(xù)采取治療方案的情況及治療時病人的心態(tài)都會對生存情況產(chǎn)生影響。同時未做亞組分析，可能也會對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。另外，本研究可能存在一些其他的因素未被排除，從而對結(jié)果產(chǎn)生影響。若想進(jìn)一步研究，提高預(yù)測的準(zhǔn)確性及化療選藥的針對性，需增加樣本例數(shù)，采用隨機(jī)分組，并采用多個可能對研究有影響的耐藥指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測。

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