薛 敏，呂 雉，伍 英，姜士寬，陳 婧，孟子暉*

1北京理工大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，北京 100081;2云南省熱帶作物研究所，景洪 666100

白堅(jiān)木皮醇(L-Quebrachitol)具有很高的藥用價(jià)值，可治療糖尿病、癌癥、抑制血管增生以及用于抗生素和酶藥物的合成［1-4］。在護(hù)膚品、香皂中加入白堅(jiān)木皮醇，可達(dá)到去皺和增加彈性的作用，近年來備受生物、醫(yī)藥專家的關(guān)注。另外，由于結(jié)構(gòu)上的單一旋光性手性結(jié)構(gòu)單元，可作為手性試劑，是合成肌醇衍生物的重要原料。白堅(jiān)木皮醇最早在巴西白堅(jiān)木的樹皮中發(fā)現(xiàn)，后來證明在銀樺、夾竹桃、紫堇等植物中都存在著白堅(jiān)木皮醇，含量在0.4% ～0.7%左右。在我國(guó)云南地區(qū)，制膠廠每年都會(huì)排放大量的制膠廢水，其中白堅(jiān)木皮醇含量可高達(dá)1.2%［5-7］，有報(bào)道從天然橡膠的制膠廢液中提取白堅(jiān)木皮醇［8-12］，所得樣品純度不高，Martina Diaz［13］等人在從膠乳中提取后用1H-NMR對(duì)其作了定性，也有從其他植物中提取的，比如 Heikki Kallio［14］等人用5 μm的氨基柱從沙棘果提取液中分離得到白堅(jiān)木皮醇。

強(qiáng)極性的天然產(chǎn)物水溶性活性成分的色譜分析是當(dāng)前分析化學(xué)以及植物化學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)挑戰(zhàn)，由于其在傳統(tǒng)的反相色譜(RPLC)中保留能力較弱，因而難以有效分離。而在以硅膠為固定相的正相色譜(NPLC)中會(huì)出現(xiàn)峰形前伸或拖尾、保留時(shí)間隨進(jìn)樣量改變、以及流動(dòng)相中微量水的存在會(huì)明顯影響保留值等問題，另外NPLC常用的非極性流動(dòng)相也無(wú)法為水溶性樣品提供足夠的溶解度。近年來興起的親水色譜(Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC)采用水-水溶性有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，極好地改善了樣品在流動(dòng)相中的溶解性，對(duì)強(qiáng)極性和親水性物質(zhì)有良好的保留，分離效果優(yōu)于傳統(tǒng)RPLC，因此得到越來越廣泛的關(guān)注［15，16］，并在極性天然產(chǎn)物活性成分的分析中得到了成功的應(yīng)用［17-19］。

本研究建立了HILIC法測(cè)定白堅(jiān)木皮醇的分析方法，并對(duì)比了親水色譜柱和C18色譜柱在DAD檢測(cè)器下的檢測(cè)效果，確定最佳檢測(cè)條件，對(duì)乳清提取物以及制膠廢水等實(shí)際樣品進(jìn)行了分析測(cè)試，效果良好，對(duì)分離機(jī)理進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜(日本島津公司);SPDM20A型二極管陣列檢測(cè)器(DAD，日本島津公司);KH5200型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。白堅(jiān)木皮醇(百靈威科技有限公司);乙腈(MeCN，色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);制膠廢水和乳清提取物由云南熱帶作物所提供;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(艾科浦超純水系統(tǒng))。

1.2 樣品溶液的配制

精確稱取40 mg白堅(jiān)木皮醇標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，加入超純水至刻度，配置成4 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液備用。取10 mL含白堅(jiān)木皮醇的制膠廢水，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾備用。

1.3 色譜分析

SHISEIDO PC HILIC色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);Agela Venusil MP C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;DAD檢測(cè)波長(zhǎng):190 nm。

C18色譜柱檢測(cè)條件:取配好的4 mg/mL白堅(jiān)木皮醇標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋成2 mg/mL用于HPLC檢測(cè)。色譜柱為Agela Venusil MP C18，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm，進(jìn)樣量為 5 μL。

親水色譜柱檢測(cè)條件:取配置好的2 mg/mL白堅(jiān)木皮醇標(biāo)準(zhǔn)液，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm，進(jìn)樣量為5 μL。

圖1 白堅(jiān)木皮醇HPLC-DAD色譜圖Fig.1 HPLC-DAD chromatograms of L-quebrachitol with C18column

2 結(jié)果與討論

2.1 C18柱檢測(cè)白堅(jiān)木皮醇

從圖1可以看出，白堅(jiān)木皮醇在C18柱中出峰時(shí)間約在2.3 min左右，由于C18反相色譜柱填料極性小，而白堅(jiān)木皮醇極性較大，所以在柱中幾乎沒有保留。此外，隨著流動(dòng)相中乙腈的含量由20%增加至80%，白堅(jiān)木皮醇出峰時(shí)間沒有太大變化，保留因子基本不變，這說明C18色譜柱不適合用來分離鑒定白堅(jiān)木皮醇這種強(qiáng)極性水溶性化合物。

2.2 HILIC分離模式下流動(dòng)相配比與保留因子的關(guān)系

從圖2可以看出，采用SHISEIDO PC HILIC色譜柱、DAD檢測(cè)器，隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少，水含量的增加，即流動(dòng)相整體極性的增大，白堅(jiān)木皮醇同HILIC柱上的極性配體磷脂(PC)作用減弱，導(dǎo)致保留時(shí)間變短，出峰更快。

圖2 白堅(jiān)木皮醇HPLC-DAD色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatograms of L-quebrachitol with SHISEIDO PC HILIC column

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈/水不同配比時(shí)待測(cè)物的分離效果(圖3)，根據(jù)保留因子(k)確定流動(dòng)相。保留因子反映了物質(zhì)在柱中的遷移速率，保留因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)，如果過長(zhǎng)，則峰展較寬，靈敏度不高;若保留因子過小，則在柱內(nèi)保留效果差，不利于分離。

圖3 保留因子同流動(dòng)相中水含量的關(guān)系Fig.3 Effects of Acetonitrile/Water ratio on the retention factor of L-quebrachitol

理論上k=0.5～10均能滿足分離需求，在0.5～1.5之間為最佳，從圖3可以看出，k隨著乙腈含量的減小而減小，在流動(dòng)相比例為6∶4和5∶5時(shí)，保留因子都在1左右，均適合本實(shí)驗(yàn)，但相比之下，比例為6∶4時(shí)出峰時(shí)間為4.3 min，可以避免溶劑峰的干擾，峰形更對(duì)稱，因此本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相為乙腈/水(V/V，60/40)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

以配制好的4 mg/mL白堅(jiān)木皮醇標(biāo)準(zhǔn)液為儲(chǔ)備液，分別稀釋成 2、0.8、0.1、0.08、0.05 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以HPLC分別測(cè)定包括儲(chǔ)備液在內(nèi)的6個(gè)濃度下白堅(jiān)木皮醇的峰面積，流動(dòng)相取乙腈-水(V/V)6∶4，以峰面積積分值(y)對(duì)白堅(jiān)木皮醇濃度(x，mg/mL)做線性回歸，得到線性方程，以3倍信噪比(S/N=3)為譜峰值，求出檢測(cè)限(如表1)。

表1 白堅(jiān)木皮醇標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限Table 1 Standard curve and detection limit of L-quebrachitol

2.4 用色譜條件檢測(cè)白堅(jiān)木皮醇濃縮品

取2 mg/mL乳清提取物溶液，在高效液相色譜檢測(cè)，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC;流動(dòng)相為乙腈-水(V/V，60/40);檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD);檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm;色譜圖如圖4。

圖4 白堅(jiān)木皮醇濃縮品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of concentrated L-quebrachitol product

從圖4可以看出，乳清提取物中雖含白堅(jiān)木皮醇，但仍有較多雜質(zhì)，利用本研究建立的親水色譜法基本可以將白堅(jiān)木皮醇和其他雜質(zhì)分開，出峰時(shí)間在4.3 min左右。

2.5 制膠廢水中白堅(jiān)木皮醇的檢測(cè)

將已經(jīng)過處理的含白堅(jiān)木皮醇的制膠廢水用HPLC檢測(cè)，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC，流動(dòng)相為乙腈-水(V/V，60/40)，檢測(cè)器選擇 DAD，柱溫為25℃，所得色譜圖在4.3 min左右有一個(gè)很明顯的吸收峰，白堅(jiān)木皮醇和雜質(zhì)沒能達(dá)到很好的基線分離，但根據(jù)相同實(shí)驗(yàn)條件下保留時(shí)間推算，基本確定此峰為白堅(jiān)木皮醇。

圖5 制膠廢水色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of latex wastewater

2.6 分離機(jī)理

根據(jù)Alpert的研究［20］，強(qiáng)極性樣品白堅(jiān)木皮醇在HILIC中的保留是基于分配理論，當(dāng)使用水溶性有機(jī)相-水為流動(dòng)相時(shí)，親水性的固定相表面會(huì)產(chǎn)生一層富水層，而化合物就溶解入富水層中。Shiseido PC HILIC色譜柱采用的是硅膠表面鍵合磷酸膽堿(PC)的技術(shù)，PC是細(xì)胞膜的組成部分，具有三甲胺內(nèi)脂結(jié)構(gòu)。作為超親水性基團(tuán)，PC修飾于硅膠表面，從而使親水性物質(zhì)白堅(jiān)木皮醇在色譜柱內(nèi)有所保留。實(shí)驗(yàn)證明，該色譜柱對(duì)水溶性物質(zhì)具有很好分離性能，同時(shí)具有較好的分離的穩(wěn)定性和高效性。

3 結(jié)論

根據(jù)白堅(jiān)木皮醇的水溶性，建立了親水作用色譜柱測(cè)定其含量的HPLC方法。解決了常規(guī)C18色譜柱無(wú)保留、含量測(cè)定不穩(wěn)定的問題。該方法準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的制膠廢水中白堅(jiān)木皮醇的檢測(cè)，更精確的檢測(cè)條件將進(jìn)一步研究。該方法對(duì)其他天然產(chǎn)物極性水溶性有效成分的色譜分析也有很好的借鑒作用。

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