楊 婷，孫智達(dá)，謝筆鈞，胡崇琳

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

糯米香茶(Strobilanthes tonkinesis Lindau)，為爵床科馬藍(lán)屬多年生草本植物［1］。因其具有獨(dú)特的糯米清香而得名，它含有豐富的芳香成分和對(duì)人體有益的氨基酸，具有清熱解毒、養(yǎng)顏抗衰、補(bǔ)腎健胃的功效，被譽(yù)為“美容茶”［2］。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)糯米香茶中含有豐富的生物活性物質(zhì)角鯊烯，使得糯米香茶成為提取角鯊烯的潛在植物資源，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。

角鯊烯是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，化學(xué)名稱為 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯酸，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)及新陳代謝等作用［3］。角鯊烯最早發(fā)現(xiàn)于深海鯊魚肝臟中，后研究人員從植物中提取得到不同含量的角鯊烯，其中譚樂和等人發(fā)現(xiàn)糯米香茶中角鯊烯含量較為豐富［4］，但尚未建立準(zhǔn)確測(cè)定糯米香茶中角鯊烯含量的檢測(cè)方法。本文在前人的基礎(chǔ)上建立一種反相高效液相色譜(RPHPLC)準(zhǔn)確測(cè)定糯米香茶中角鯊烯含量的方法，為進(jìn)一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:waters e2695高效液相色譜儀，PAD檢測(cè)器，色譜柱:DiamonsilTMC18;X-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;SH2-III型循環(huán)水真空泵;Fuhe HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋;

試劑:甲醇、乙腈均為色譜純(Tedia，美國);石油醚(30～60℃)為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司);角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，美國)，純度99%;

1.2 實(shí)驗(yàn)材料來源

糯米香茶原種采自云南景洪一農(nóng)家茶園，種植在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室。取成熟葉片，陰干后用于提取角鯊烯。

1.3 色譜條件

C18色譜柱(200 ×4.6 mm，5 um)(迪馬，美國)，流動(dòng)相甲醇/乙腈體積比為60/40(v/v)，采用等度洗脫，流速為1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為 210 nm［5-7］。

1.4 樣品制備

采用索氏提取法提取糯米香茶角鯊烯:稱取20.0020 g糯米香茶干燥粉末(40目)并用濾紙包裹裝入索氏提取器中，控制水浴溫度恒為60℃，加入500 mL含有0.5%BHT的石油醚(30～60℃)回流提取10 h后浸泡8 h，收集石油醚提取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去石油醚，得到深綠色脂溶物，用甲醇定容至 50 mL 容量瓶中［3，8-10］。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品25.9 mg，用無水甲醇定容至25 mL容量瓶中，超聲波輔助溶解，得到濃度為1.036 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋 10倍得到0.1036 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 流動(dòng)相的選擇

角鯊烯為不飽和的烴類化合物，采用反相色譜檢測(cè)提取液中角鯊烯含量，調(diào)整甲醇/乙腈的比例進(jìn)行測(cè)試，得出在甲醇∶乙腈=60∶40(v/v)時(shí)有較好的分離效果，色譜圖如圖1所示。并設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，總流速為1.2 mL/min，柱溫控制在40℃。在此色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜得到充分分離，標(biāo)品角鯊烯保留時(shí)間為18.970 min，樣品中角鯊烯保留時(shí)間為18.989 min，兩者保留時(shí)間基本一致［5-6，11-14］。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standards

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(Rt=18.970 min)的紫外波長(zhǎng)圖譜顯示角鯊烯最大吸收波長(zhǎng)為203.6 nm，索氏提取法提取的糯米香茶中角鯊烯(Rt=18.989 min)的紫外波長(zhǎng)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品相符，最大吸收波長(zhǎng)亦為203.6 nm。認(rèn)為在該色譜條件下角鯊烯的最大吸收波長(zhǎng)即為203.6 nm。如圖3，4所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣 4，8，12，16，20 uL，按2.3色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，得角鯊烯的回歸方程為 Y=344.04X – 21.677，R2=0.9999 ，結(jié)果表明角鯊烯在 0.4144 ～ 2.0720 ug 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［5，6］。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果Table 1 The standard curve

2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

以0.1036 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣體積為20 uL，按照2.3 HPLC色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果如表2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.56%(n=6)。

表2 角鯊烯精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of accuracy test(n=6)

2.5 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精確稱量20.0000 g糯米香茶粉末，采用1.4索氏提取法提取樣品溶液，精確量取3.0 mL的樣品溶液三份至潔凈的帶塞試管中，分別加入 1.0、2.0、3.0 mL 濃度為 0.1036 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，超聲助溶10 min，進(jìn)行HPLC法定量分析，結(jié)果如表3所示。符合《中國藥典》2005版第 I部 95% ～ 105% 的規(guī)定［7，15，16］。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of recovery experiment

2.6 供試液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取糯米香茶干燥粉末樣品20.0000 g，按照1.4提取方法制成供試液，每隔40 min進(jìn)樣1次，按1.3 HPLC色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算出角鯊烯含量，結(jié)果見表4。

經(jīng)計(jì)算得到峰面積平均值為4049.527 v·s，RSD為 1.41%，符合《中國藥典》2005年版 I部RSD＜2% 的要求，表明采用索氏提取法提取得到的供試液穩(wěn)定性較好。

表4 供試液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of sample stability test

2.7 樣品測(cè)定

精確吸取樣品溶液4 uL進(jìn)樣，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中角鯊烯含量，計(jì)算得出20 g糯米香茶粉末中角鯊烯平均含量約為14.79 mg，即0.0739% 。

3 結(jié)論

建立測(cè)定糯米香茶中角鯊烯含量的高效液相色譜法，證實(shí)糯米香茶中含有豐富的生物活性物質(zhì)角鯊烯，其含量約為72.71 mg/100 g糯米香茶干燥粉末。

實(shí)驗(yàn)確定高效液相色譜條件為:DiamonsilTM C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇/乙腈=60/40，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為1.2 mL/min，柱溫40℃。在此條件下角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品及糯米香茶中角鯊烯分離效果均良好，HPLC測(cè)定方法經(jīng)檢驗(yàn)其線性關(guān)系、精密度、回收率、供試液穩(wěn)定性等均符合分析要求。該方法適用于糯米香茶中角鯊烯含量的測(cè)定。

1 Wu G(吳剛)，Ma S(馬帥)，Zhang CL(張翠玲)，et al.A-nalysis to Genetic Diversity in Strobilanthes tonkinensis by RAPD.Chin J Trop Crops(熱帶作物學(xué)報(bào))，2011，32:1320-1324.

2 Zhang CL(張翠林).Study on development of Semnostachya menglaensis in Hainan province.Chin J Trop Crops(熱帶作物科技)，1999，4:62-63.

3 Zhou JX(周金煦)，Li XY(李曉玉)，Tang BD(湯寶娣)，et al.Anti-tumor and immunomodulatory effects of Squalene.Chin J Pharm Toxi(中國藥理與毒理學(xué)雜志)，1990，4:151-152.

4 Tan YH(譚樂和)，Yin GH(尹桂豪)，Zhang CH(章程輝)，et al.Supercritical CO2Extraction and GC-MS Analysis of Leaf Volatile Constituents in Teucrium manghuaense.Chin J Trop Crops(熱帶作物學(xué)報(bào))，2008，29:530.

5 Liang XH(梁新華)，Zheng CX(鄭彩霞)，Zhang FX(張鳳俠).Extraction and HPLC Analysis of the Squalene in Glycyrrhiza uralensis F isch.Chin J Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國醫(yī)國藥)，2010，21:1856-1857.

6 Chen QB(陳全斌)，Cheng ZQ(程忠泉)，Yang JX(楊建香)，et al.The HPLC Analysis of the Squalene inSiraitia grosvenorii Seed Oil.Chin J Guang Xi Sci(廣西科學(xué))，2006，13:118-120.

7 Dai YH(戴宇航).Research on Separation and Extraction of Squalene from olive oil.Tianjin University(天津大學(xué))，PhD.2009.

8 Guan B(官波)，Zheng WC(鄭文誠).Extraction and purification of squalene and its application.Chin J Sci Tech of Cereals，Oils and Foods(糧油食品科技)，2010，18(4):27-30.

9 Wu SM(吳時(shí)敏).Development and application of Squalene.Chin J Cereals and Oils.(糧食與油脂)，2001，1:31.

10 Xu RB(許瑞波)，Liu WW(劉瑋煒)，Zhang MY(張明艷)，et al.The progress of preparation and application of Squalene.Chin J Shandong Med(山東醫(yī)藥)，2005，45(35):69-70.

11 He HP，Cai YZ，Sun M，et al.Extraction and purification of squalene from Amaranthus grain.J Agric Food Chem，2002，50，368-372.

12 Lu HT，Jiang Y，Chen F.Determination of squalene using High-performance liquid chromatography with diode array detection.J Chromatographia，2004，59:367-371.

13 Ryan E，Galvin K，O’connor P，et al.Phytosterol，squalene，tocopherol content and fatty acid profile of selected seeds，grains，and legumes.J Plant Foods Hum Nutr，2007，62:85-91.

14 Sulpice JC，F(xiàn)erezou J.Squalene Isolation by HPLC and quantitative comparison by HPLC and GLC.J Lipids，1984，19:631-635.

15 Qi DZ(齊德珍).Research on Separation and Extraction of Squalene from SODD.Tianjin University(天津大學(xué))，PhD.2010.

16 Chen ZQ(陳忠泉).The Study on Separation，Purification of Luohanguo Squalene and Lipidic Components of Luohanguo Residue.Guangxi Normal Univ(廣西師范大學(xué))，PhD.2005.