丁亞平，邢少青，張成森，胡中立，歐陽天贄，靳素榮*

1武漢理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系;2武漢大學(xué)蓮藕中心，武漢 430070

荷葉(Lotus leaf)為睡蓮科蓮屬(Nelumbl Nuciferea Gaertn)植物的葉，資源豐富、分布廣泛，在我國各省普遍栽培，是一種既是食品又是藥品的天然植物原料［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，荷葉苦、平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有清解暑熱，升發(fā)清陽，涼血止血的功效。研究表明荷葉具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抑菌消炎［2-5］等功能。目前有關(guān)荷葉的研究主要集中在荷葉中活性化學(xué)成分的提取及功能研究等方面［6-9］。荷葉提取物化學(xué)成分復(fù)雜，其藥理活性大多是多成分之間協(xié)同作用的結(jié)果，但目前提取物質(zhì)量及藥效的控制仍沿用定量分析總黃酮、總生物堿等幾種主要成分的陳舊模式，不足以全面評價荷葉提取物質(zhì)量的優(yōu)劣。因此本研究采用HPLC色譜法對不同品種荷葉樣品進行了指紋圖譜研究，為荷葉藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑和藥材

主要儀器:Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent化學(xué)工作站，依利特UV230+紫外-可見檢測器，色譜柱:依利特 Sino Chrom(4.6 mm ×200 mm，5 μm)柱，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

主要試劑:甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、磷酸氫二鈉為優(yōu)級純，水為重蒸水，槲皮素對照品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司批號:F20061117)。

藥材:荷葉樣品由武漢大學(xué)蓮藕研究中心提供，見表1。

表1 荷葉測試樣品Table 1 The serial numbers and sources of Lotus leaf samples

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

稱取槲皮素對照品適量，甲醇溶解，配制成濃度為0.2000 mg/mL的溶液，作為參照物溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取不同品種荷葉干粉約2 g，加入10%乙醇溶液120 mL，浸提6 h，過濾，減壓蒸餾，甲醇溶解，定容至100 mL，搖勻，各樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為荷葉樣品供試液。

2.3 色譜條件

色譜柱:依利特 Sino Chrom(4.6 mm×200 mm，5 μm);流速:1.5 mL/min;檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣量:10 μL.流動相:由A、B兩相組成，A 相為乙腈，B 相為 H3PO4-NaH2PO4(0.1 mol/L，pH 2.5)溶液，梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.4 樣品測定方法

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 uL，在擬定的色譜條件下進行測定，經(jīng)分析比較各樣品的色譜圖，從中選定了12個共有峰作為構(gòu)成指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，見圖1和圖2。其中12號峰為荷葉主要指標(biāo)成分槲皮素，將其作為參照峰，令其保留時間和峰面積分別為1，其他各峰的保留時間和峰面積分別與參照峰的保留時間和峰面積相比，作為各峰的相對保留時間和相對峰面積。

圖1 槲皮素對照品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度實驗

取泰籽11號樣品制備的同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次。結(jié)果表明，所得各色譜峰的相對保留時間的RSD為0.077% ～0.33%，相對峰面積的RSD為1.04% ～2.99%，均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

3.2 穩(wěn)定性實驗

取泰籽11號荷葉制備的同一供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖中各色譜峰的保留時間和峰面積。結(jié)果表明，指紋圖譜的全貌無明顯變化，各色譜峰的相對保留時間RSD為0.083% ～0.46%，相對峰面積RSD為1.04% ～1.88%，均小于3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性實驗

取泰籽11號樣品5份，按照供試品溶液制備方法制備，分別進樣檢測。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.37% ～1.06%，相對峰面積的RSD為1.37% ～2.57%，均小于3%。表明方法的重復(fù)性良好。

圖3 10批不同品種荷葉HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of different variety Lotus leaves

3.4 指紋圖譜的建立與分析

按照上述測定方法，對1～10號樣品按2.3色譜條件進行測試。通過對10批荷葉供試品的測定，以槲皮素對照品做荷葉指紋圖譜的參照物，比較各批樣品的色譜圖發(fā)現(xiàn)，其中12個峰是10批荷葉共有的，因此確定它們?yōu)楣灿蟹?圖3)。以12號峰為參照峰，計算10批供試品圖譜中各共有峰的相對保留時間的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3、表4。

表3 10批荷葉樣品共有峰的相對保留時間Table 3 Relative retention times of common peaks for ten batches of Lotus leaves

表4 10批荷葉共有峰的相對峰面積Table 4 Relative peak areas of common peaks for ten batches of Lotus leaves

4 討論

本研究首次建立了荷葉HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明其指紋圖譜相互間較為吻合，雖然由于樣品的個體差異，特征峰的相對量存在一定的差異，但整體輪廓均符合共有特征。同時從其整體色譜圖入手，選取了12個特征峰構(gòu)成了荷葉的指紋圖譜，以共有模式作為荷葉的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，能提供更全面的質(zhì)量控制信息。實驗證明該方法操作性強，重現(xiàn)性好，可以作為荷葉內(nèi)在質(zhì)量控制的評價方法，同時也可作為荷葉主成分制劑指紋圖譜研究的基礎(chǔ)。

4.1 樣品處理方法選擇

對荷葉樣品，最初采用30%乙醇微波輔助提取處理，直接進樣，從其色譜圖上可明顯看出，樣品出峰聚集在10 min以前，給鑒別造成很大困難，選用10%乙醇浸提后，使色譜圖的整體面貌得以改善。

4.2 檢測波長的確定

黃酮類物質(zhì)在紫外-可見區(qū)域有兩個吸收峰，分別在240～285 nm和300～360 nm處，本實驗采用二極管陣列檢測器對在240～360 nm各波長下的色譜圖進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大于280 nm波長下其色譜圖基線噪音較大，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的基線漂移現(xiàn)象，且樣品出峰數(shù)少，分離度較差。而在小于280 nm波長下，其色譜圖基線噪音較低，所洗脫的組分均有較高的響應(yīng)值，且分離度好，綜合比較后選擇254 nm為檢測波長。

4.3 流動相的選擇

在實驗過程中比較了不同pH的甲醇-水、乙腈-水溶液和乙腈-磷酸鹽緩沖液。結(jié)果表明，乙腈-磷酸鹽緩沖液梯度洗脫系統(tǒng)為最佳，各色譜峰分離度較好，保留時間適中，并且所有成分均在60 min內(nèi)出峰。

色譜指紋圖譜是通過比較各樣本間色譜圖的差異來反映樣品化學(xué)成分間的差異，不同品種荷葉的指紋圖譜相似，共有峰面積占峰總面積90%以上，非共有峰均為在樣品中含量較少不穩(wěn)定的峰。各共有峰都存在，但峰面積及相對峰面積卻有差異。因此可通過荷葉HPLC指紋圖譜反映不同品種荷葉內(nèi)在質(zhì)量的差別。

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