田宏哲，徐 靜，胡 睿，趙瑛博，劉文娥

1沈陽農(nóng)業(yè)大學分析測試中心，沈陽 110866;2遼寧出入境檢驗檢疫局，大連 116001

我國具有豐富的天然植物資源，其中五味子及其同科類植物在我國分布范圍很廣，是常用中藥材。五味子科(Schisandraceae)含五味子屬(Schisandra)和南五味子屬(Kadsura)2個屬約60種，我國含有兩屬的植物約30種。其中五味子屬約19種，在我國大部分省區(qū)都有分布，該屬最常用的藥材是五味子(S.chinensis，北五味子)和華中五味子(S.sphenanthera)。五味子屬植物主要含有木脂素、三萜、揮發(fā)油、多糖、有機酸、氨基酸及微量元素等化學成分。其中，木脂素為其主要活性成分，有降酶保肝、抑制中樞神經(jīng)、抗衰老等作用。20世紀70年代，我國學者從五味子中分離得到五味子素等7種具有明顯降谷丙轉氨酶(SGPT)作用的木脂素后，中國和日本的學者［1-4］對五味子及其同科植物的木脂素成分展開了廣泛的分離鑒定工作，獲得了顯著成果，目前五味子的開發(fā)應用也主要是集中在治療肝炎的新藥方面。

木脂素是由二分子苯丙烯衍生物聚合而成的化合物，多數(shù)為游離狀態(tài)，或與糖結合成甙。五味子中含有豐富的木脂素成分，從植物中提取的木脂素類物質活性廣泛，有多種生理活性。如經(jīng)過進一步結構修飾和改造，可能獲得更高效的藥物活性成分［5，6］，這是我國天然藥物開發(fā)的重要方向之一，值得進一步研究。

目前測定五味子中木脂素主要采用液相色譜-紫外法［7-10］、液相色譜-質譜法［11］、薄層色譜法［12］等，但五味子木脂素衍生物較多，立體化學復雜，采用液相色譜-紫外法很難將復雜組分完全分開，影響定量準確性。而薄層色譜法由于分離效率低，不適于復雜組分分離。

本文建立了LC-MS/MS法同時測定五味子中6種木脂素成分，采用正己烷提取待測樣品中的目標組分，經(jīng)反相高效液相色譜分離，待測組分先后進入DAD檢測器和離子阱質譜中進行測定，該方法排除了樣品基質和雜質成分的干擾，可對目標組分進行準確的定性定量。通過對五味子樣品中6種木脂素成分的測定，對該方法進行評價。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 LC-Trap SL進行五味子中木脂素的液相色譜-質譜測定，配有四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器(DAD)等。質譜直接進樣注射泵(kd Scientific，USA)。KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

甲醇(色譜純，F(xiàn)luka)。實驗用“娃哈哈”純凈水(娃哈哈集團，杭州)，其它試劑均為分析純。配制的流動相均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾。木脂素標準品:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(純度 ＞99.0%，購自Sigma-Aldrich)。以上標準樣品用色譜純?nèi)軇┡涑?000 mg/L的儲備液，然后稀釋到1.0 mg/L進行流動注射進樣，分別獲取標準樣品的一級和二級質譜圖，得到準分子離子峰和碎片離子峰的信息。北五味子果來源于遼寧撫順藥材種植基地。

1.2 樣品制備

將五味子果實在80℃左右烘4 h，然后粉碎過100目篩。準確稱取1.0 g五味子粉末，用50 mL正己烷超聲提取30 min后，用正己烷補足損失量，移取20 mL提取液到離心管中，離心10 min(3500 r/min)。取5 mL上清液于雞心瓶中，在40°C水浴蒸至近干，然后用5 mL甲醇重新溶解，過0.45 um濾膜，待分析。

1.3 液相色譜條件

SB-C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm，Agilent)，流動相為甲醇和0.5%甲酸，梯度洗脫，0～35 min甲醇由55%到95%，保持5 min，然后回到初始流動相組成，平衡7 min，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，檢測波長260 nm。

1.4 質譜條件

ESI電離源，正離子化模式;干燥氣:8.0 L/min;干燥溫度:325°C;霧化氣壓力:30 psi;毛細管電壓:4500 v。掃描范圍:100～650 m/z。多反應模式監(jiān)測(MRM)(液相色譜-質譜聯(lián)用優(yōu)化參數(shù)見表1)。

表1 采用液質聯(lián)用方法分析目標五味子木脂素的優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimised parameters for the studied lignans analysed by LC-ESI-MS/MS

2 結果與討論

2.1 木脂素的液相色譜-質譜檢測方法建立

首先考察了不同流動相對目標組分分離的影響:甲醇-醋酸銨、甲醇-甲酸銨、甲醇-甲酸水溶液等，幾種流動相都能把目標組分完全分離。但在分離實際樣品時，以甲醇-甲酸水溶液的分離效果最好，在液相色譜-紫外檢測中譜峰尖銳，在質譜中離子化效率高(見圖1)，所以選擇甲醇-甲酸水溶液作為本方法的流動相。

在190～400 nm內(nèi)對目標組分進行了紫外吸收波長掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm左右時，6種木脂素均有響應，且響應值較高，因此選擇260 nm作為檢測波長，標樣譜圖見圖2。

實驗中對質譜分析條件進行了優(yōu)化:確定質譜離子化模式、干燥氣壓力、溫度、霧化電壓、傳輸及聚焦區(qū)參數(shù)設置等。由于在液相色譜-質譜聯(lián)用分析有機化合物時，當采用電噴霧電離源(ESI)時，一級質譜全掃描模式只能提供目標組分的分子離子峰，很難排出雜質成分的干擾，會造成定性以及定量的誤差。本文建立了LC-ESI-MS/MS方法分析木脂素組分，以MRM模式提供的目標組分的母離子與子離子組成的離子對進行定性和定量分析(見表1)，從而排除其它組分及未完全分離組分對目標組分的定量干擾。

2.2 提取溶劑的選擇

目前，提取五味子中木脂素主要采用乙醇、甲醇、正己烷、環(huán)己烷及氯仿等有機溶劑進行超聲提取、索氏提取或者微波提取等。在本實驗中嘗試了幾種提取溶劑:甲醇、正己烷、環(huán)己烷、95%乙醇、乙酸乙酯及甲醇-三氯甲烷混合溶劑。實驗發(fā)現(xiàn)，環(huán)己烷及乙酸乙酯對6種木脂素提取效率都較低，不能滿足方法要求;其它4種提取溶劑對幾種木脂素成分皆有較高的提取效率，其中95%乙醇雖然對五味子醇甲提取率最高，但對其它目標組分提取率較低，(見表2)。綜合考慮，最后選擇正己烷作為6種木脂素的提取溶劑，能夠保證所有目標組分都有較高的提取效率。

表2 6種提取溶劑的提取效率(mg/g)Table 2 Effect of different extraction solvents(mg/g)

圖1 采用MRM模式分析6種木脂素標樣(0.05 mg/g)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 6 lignans(0.05 mg/g)monitored by MRM transitions

2.3 LC-ESI-MS/MS分析木脂素的方法評價

在上述實驗條件下測定6種目標組分的標準溶液，以峰面積為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標作圖，線性濃度范圍為0.005～10.0 mg/g:確定了6種目標組分的檢測限(S/N=3)、定量限(S/N=5)、線性方程及線性相關系數(shù)(見表3)。目標組分的定量限為4.0×10-4～1.5 ×10-3mg/g，檢測限為 2.5 ×10-4～9.0×10-4mg/g，本文所建立的6種木脂素測定方法完全可以滿足實際樣品中目標組分的檢測要求。

圖2 采用HPLC-DAD分析6種木脂素標樣(0.05 mg/g)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 lignans standard solutions(0.05 mg/g)analysed by HPLC-DAD

采用回收率試驗進行方法評價，準確稱取已知含量樣品作為空白基質，分別定量加入6種木脂素標準溶液(添加濃度分別為 0.5，2.0，5.0 mg/g)，然后按照實驗方法進行提取和分離檢測。每個添加水平進行6次重復試驗，測得添加6種目標組分的平均回收率為81.01% ～ 92.45%，RSD 為3.05% ～7.98%，因此，本方法具有很高的準確度和精密度。

表3 LC-ESI-MS/MS聯(lián)用方法分析6種木脂素的定量限、檢測限及線性相關系數(shù)Table 3 Limits of quantification(LOQ)，limits of detection(LOD)and correlation coefficients of 6 lignans analysed by LC-MS/MS

2.4 實際樣品測定

將實驗中所建立的五味子木脂素提取方法和分離檢測方法應用于20批五味子果實中的木脂素測定，實際樣品測定質譜總離子流圖見圖3，液相色譜-紫外譜圖見圖4。本方法提供了兩種定性方法:通過液相色譜-紫外方法可獲得樣品中各組分的保留時間信息、通過質譜可得到各組分的監(jiān)測離子對及其它子離子信息。通過這兩種方法可對實際樣品的組分進行定性，確定在所有批次樣品中同時含有6種待測目標組分:其中五味子醇甲含量為6.67±0.33 mg/g，五味子醇乙2.80 ±0.14 mg/g，五味子酯甲0.83 ±0.05 mg/g，五味子甲素 1.21 ±0.07 mg/g，五味子乙素 3.81 ±0.18 mg/g，五味子丙素 0.90±0.06 mg/g。

3 結論

本實驗建立了LC-MS/MS法測定五味子果實中6種木脂素成分，該方法樣品前處理簡單、提取效率高、分離效果好、完全排除了其它成分對目標組分的定性和定量分析干擾。采用該方法對五味子果實進行分析，確定了其中6種木脂素成分的含量，結果表明在北五味子果實中五味子醇甲含量最高，五味子酯甲含量最低。本研究為建立五味子藥材的質量分析方法提供了參考依據(jù)、為五味子藥材的充分利用提供有力的技術支持。

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