張 楊， 張朝賢， 王金信＊， 魏守輝， 黃紅娟＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點開放實驗室，北京 100193）

牛筋草［Eleusine indica（Linn.）Gaertn.］俗稱油葫蘆草、蟋蟀草、千人踏等，屬禾本科屬一年生草本植物，生長于較濕潤的農(nóng)田或路旁，廣布全國各地。對棉花、玉米、大豆、花生等作物危害較重，為近年來較難防除的雜草之一，滅生性除草劑草甘膦防除效果不理想。目前，有關(guān)牛筋草的研究主要集中在其對除草劑產(chǎn)生抗性方面［1－2］，針對其遺傳多樣性的研究未見報道。

簡單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（inter－simple sequence repeat，ISSR）是 Zietkiewicz等［3］于1994年在微衛(wèi)星技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR技術(shù)是一種顯性標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點［3－4］，克 服 了 RFLP 和 RAPD 的 限 制［4－5］，具 有 引物序列較長、退火溫度較高、重復(fù)性較好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性高［6］、成本低、操作簡單、所需DNA模板量少等特點，因而備受青睞。但I(xiàn)SSR是基于PCR的一種分子標(biāo)記技術(shù)，受多種因素的影響，而且反應(yīng)因子所需條件不合適會導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物消失，圖譜彌散等，因此在進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記時應(yīng)首先對其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化［7－8］。

目前，許多領(lǐng)域都已利用ISSR技術(shù)進(jìn)行科學(xué)研究，例如種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、植物進(jìn)化和遺傳多樣性分析等領(lǐng)域。國內(nèi)將ISSR技術(shù)用于雜草相關(guān)基因標(biāo)記的研究報道較少［9－12］，也未見應(yīng)用于牛筋草遺傳多樣性研究的報道。本文通過研究影響牛筋草ISSR反應(yīng)體系的相關(guān)因素、建立與優(yōu)化牛筋草ISSR－PCR反應(yīng)體系，為ISSR標(biāo)記在雜草遺傳多樣性的研究方面提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：牛筋草，其種子于2009年采自安徽阜陽路旁。將飽滿的牛筋草種子播在高9.2cm，直徑10.5cm的花盆中。培養(yǎng)土壤為黏土，pH 6.8，有機質(zhì)含量在1.9%左右，土壤與草木炭按體積3∶1混合使用。室內(nèi)白天溫度為（28±5）℃，晚上溫度為（23±5）℃，每天光照11h，相對濕度為（75±5）%，正常水肥管理。取3～4葉期幼苗供試。

供試引物、試劑及儀器設(shè)備：用于ISSR－PCR反應(yīng)的試劑，dNTP、Taq DNA 聚合酶、Mg2＋、10×PCR Buffer，均購自寶生物（TaKaRa）工程公司。所用引物參照哥倫比亞大學(xué)（University of Columbia）公布的ISSR引物序列，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，試驗所用儀器設(shè)備均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點開放實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，離心柱型）提取新鮮牛筋草地上組織DNA，方法按照說明書進(jìn)行。經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析，核酸蛋白快速檢測儀（Eppendorf Bio Photometer）測定其在260nm和280nm處的吸光值，計算DNA純度，稀釋至30ng／μL并保存在－20℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR正交試驗設(shè)計與單因素處理

采用L16（45）正交試驗設(shè)計［13］，對ISSR－PCR的主要影響因素Taq DNA 聚合酶、dNTP、引物、Mg2＋濃度及模板DNA濃度進(jìn)行5因素4水平篩選分析，共16個處理，每處理3次重復(fù)，ISSR－PCR反應(yīng)各因素水平及正交試驗見表1。反應(yīng)體系總體積為25μL，包括10×PCR Buffer 2.5μL，其他各成分按照表1加樣，不足體積用ddH2O補足。

表1 PCR反應(yīng)因素水平L16（45）正交試驗設(shè)計表

單因素試驗在正交試驗最優(yōu)體系的基礎(chǔ)上，將單個因子按照一定梯度變化，其他因子保持不變，逐個篩選出各因子的最優(yōu)擴(kuò)增條件，組成適合于牛筋草的ISSR－PCR最佳反應(yīng)體系。各因子濃度梯度處理見表2。

表2 各因子濃度梯度

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

PCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，l×TAE緩沖液，電壓120V，電泳1.5h，于UVP凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存，并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析，確定牛筋草ISSR－PCR反應(yīng)各影響因素的最佳水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果

引物UBC835對安徽阜陽牛筋草擴(kuò)增試驗結(jié)果見圖1。譜帶較為豐富清晰的為組合13、14、15和16，組合5、12條帶模糊，組合2、3、8、9和11譜帶較弱主帶不明顯且出現(xiàn)雜帶，組合1、4、7和10多態(tài)性條帶少，而組合6無條帶。比較分析發(fā)現(xiàn)，組合14譜帶清晰，且多態(tài)性較高，確定為最優(yōu)組合，即5μL的PCR反應(yīng)體系中含：0.4mmol／L dNTP、0.3μmol／L ISSR引物、1.75mmol／L Mg2＋、1UTaq DNA 聚合酶、2.5μL 10×PCR Buffer和80ng DNA模板。

為獲得理想的ISSR－PCR體系，在組合14的基礎(chǔ)上，其他因素保持不變的情況下進(jìn)行第2輪的單因素優(yōu)化篩選試驗。

圖1 ISSR－PCR正交設(shè)計擴(kuò)增結(jié)果

2.2 退火溫度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響

在正交試驗最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，對退火溫度進(jìn)行梯度試驗以確定引物合適的退火溫度。根據(jù)所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T）［14］，在 梯 度 PCR 儀 上 設(shè) 定 退 火 溫 度（Tm±5）℃，儀器自動形成12個溫度，在其中的10個溫度上進(jìn)行擴(kuò)增，其他反應(yīng)程序與PCR正交試驗相同。擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖2），退火溫度過低情況下，擴(kuò)增特異性差，而退火溫度過高又會導(dǎo)致引物與模板結(jié)合差，出現(xiàn)電泳條帶減弱的現(xiàn)象。為提高反應(yīng)的特異性，擴(kuò)增結(jié)果相近時，優(yōu)先選擇相對較高的退火溫度，圖2中泳道7、8條帶清晰明亮，因此確定引物UBC835的退火溫度為52℃。

圖2 退火溫度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響（引物為UBC835）

2.3 Taq DNA聚合酶用量對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響

Taq DNA聚合酶的用量是影響PCR的一個重要因素，TaqDNA聚合酶濃度過低導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的合成效率降低。Taq DNA 聚合酶為0.5、0.75、1.00U和1.25U4個用量下（圖3），擴(kuò)增結(jié)果不一致。當(dāng)Taq酶用量0.5U和1.25U時合成效率低，條帶少且不清晰；用量為0.75U和1.00U時，所得擴(kuò)增條帶清晰，結(jié)合正交試驗結(jié)果確定Taq酶用量1.00U。

圖3 TaqDNA聚合酶濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響（引物為UBC835）

2.4 Mg2＋濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響

Mg2＋濃度也是影響PCR結(jié)果的重要因素之一，它是TaqDNA聚合酶的激活劑，是Taq DNA聚合酶活性重要的影響因素之一。Mg2＋與反應(yīng)液中的引物、dNTP及模板相結(jié)合，影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物與模板的結(jié)合效率以及引物二聚體的形成［15］。從擴(kuò)增結(jié)果（圖4）中可以看出，Mg2＋濃度在1.50mmol／L和1.75mmol／L時，所得擴(kuò)增結(jié)果無顯著差異，而在正交試驗結(jié)果中1.75mmol／L Mg2＋濃度擴(kuò)增結(jié)果優(yōu)于1.50mmol／L，因此確定Mg2＋最佳濃度為1.75mmol／L。

圖4 Mg2＋濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響（引物為UBC835）

2.5 dNTP濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響

dNTP是PCR的原料，過高濃度的dNTP會造成錯誤摻入，而濃度太低又會導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)率下降。從圖5中可以看出，dNTP濃度為0.8mmol／L時擴(kuò)增條帶弱，多態(tài)性差；濃度為0.2mmol／L和0.4mmol／L時擴(kuò)增所得電泳條帶清晰，多態(tài)性相對較好。結(jié)合正交試驗結(jié)果，選擇0.4mmol／L作為ISSR－PCR反應(yīng)體系中dNTP的最佳濃度。

圖5 dNTP濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響（引物為UBC835）

2.6 引物濃度對ISSR－PCR的影響

引物濃度與擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量相關(guān)，濃度偏高產(chǎn)生錯配和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物幾率高，引物二聚體的形成幾率大；濃度太低導(dǎo)致有效擴(kuò)增條帶減少。圖6中各引物濃度擴(kuò)增產(chǎn)生的電泳條帶一致，當(dāng)濃度為0.6μmol／L時條帶亮度降低，濃度為0.3、0.4、0.5μmol／L時，反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰，基本一致，擴(kuò)增效果無顯著差別，綜合考慮正交試驗結(jié)果，選擇0.3μmol／L作為ISSR－PCR反應(yīng)體系中引物的最佳濃度。

2.7 模板DNA濃度對ISSR－PCR擴(kuò)增效果的影響

DNA模板濃度范圍由所研究的物種、類群以及DNA模板純度所決定。濃度過低致使擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，過高則可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增［16］，但在一定濃度范圍內(nèi)ISSR反應(yīng)對模板含量不甚敏感。大量的研究表明ISSR－PCR對DNA模板的要求并不嚴(yán)格，濃度對PCR反應(yīng)體系的影響，不同的試材獲得的數(shù)據(jù)不盡相同［17－21］。本研究結(jié)果表明，DNA濃度在20～80ng范圍內(nèi)對擴(kuò)增結(jié)果的一致性無明顯影響（圖7），因此選定L16（45）設(shè)計中優(yōu)勢組合14組中DNA濃度80ng。

3 討論

在PCR反應(yīng)體系中，Taq酶、Mg2＋、dNTP和引物是4個主要的影響因子。物種不同，試驗條件不同，各因子之間相互影響產(chǎn)生的擴(kuò)增結(jié)果也不同。在本研究中不同處理間存在差異，因此需要對這些因子的濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳組合。Taq酶用量是影響試驗結(jié)果的重要因素之一，Taq酶濃度高不僅容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而且試驗成本高；Taq酶濃度過低則容易造成新鏈的合成效率下降。TaqDNA聚合酶還是Mg2＋的依賴性酶，對Mg2＋濃度非常敏感。Mg2＋濃度也是影響PCR結(jié)果的重要變量之一，Mg2＋濃度能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。本試驗在Mg2＋濃度范圍內(nèi)低濃度下的擴(kuò)增效果差于高濃度。底物dNTP濃度過高，造成延伸時核苷酸錯誤摻入，引起錯配。濃度過低，不僅會影響擴(kuò)增效率，而且會因dNTP過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，降低了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。引物濃度影響擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，濃度太低則無法進(jìn)行有效擴(kuò)增。

另外，循環(huán)次數(shù)、退火溫度以及延伸時間的確定也是反應(yīng)體系建立與優(yōu)化的重要內(nèi)容。但在本試驗中，上述3種因子對擴(kuò)增結(jié)果的影響不明顯，可能與引物的特異性較強以及本試驗建立的牛筋草ISSRPCR擴(kuò)增體系比較穩(wěn)定有關(guān)，導(dǎo)致反應(yīng)體系對反應(yīng)條件的變化具有較強的承受能力。延伸時間的長短和擴(kuò)增片段的長度有關(guān)，兩者呈正相關(guān)。對于低濃度模板的擴(kuò)增，則需要稍延長延伸時間，但延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。本試驗延伸時間為1min時，產(chǎn)物穩(wěn)定且?guī)拓S富適合牛筋草ISSR－PCR體系。

目前主要有單因素水平優(yōu)化試驗和正交優(yōu)化設(shè)計試驗兩種方法應(yīng)用于ISSR－PCR體系的建立和優(yōu)化。單因子試驗主要針對每個影響因子的不同水平進(jìn)行分別優(yōu)化，多被應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系中各因子情況都有一定了解的體系；正交優(yōu)化設(shè)計試驗主要針對各因子影響程度未知的情況，利用正交設(shè)計，綜合考查各種因素及其交互作用，得出體系反應(yīng)中各影響因子的最佳組合。本研究同時采用以上兩種方法，綜合優(yōu)化分析，增加了試驗結(jié)果的可靠性，為后續(xù)牛筋草的遺傳多樣性分析奠定了技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

正交設(shè)計采用直觀分析，有的研究還采用方差分析法對試驗結(jié)果進(jìn)行分析［22］，但這仍不可避免由主觀打分造成試驗誤差。且PCR受制約因素比較多，加之ISSR大部分情況下是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體與雜合體［23］，因此盡量在相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是使試驗成功的決定因素。建立客觀的ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)有助于該方法更好地應(yīng)用。

［1］ Powles S B，Preston C.Evolved glyphosate resistance in plants：biochemical and genetic basis of resistance［J］.Weed Technology，2006，20：282－289.

［2］ Baerson M S，Brinker R，Casagrande L，et al.Characterization of glyphosate resistant eleusine indica biotypes from Malaysia［C］∥Proceedings（B）17th Asian－pacific Weed Science Society Conference，Thailand：Bangkok，1999：527－536.

［3］ 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：146－161.

［4］ Bornet B，Branchard M.Nonanchored inter simple sequence repeat（ISSR）markers：reproducible and specific tools for genome fingerprinting［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2001，19：209－210.

［5］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）－anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20：176－183.

［6］ Nagaoka T，Ogihara Y.Applicability of inter－simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，1997，94：597－602.

［7］ 劉海河，侯喜林，張彥萍.西瓜ISSR－PCR體系的正交優(yōu)化研究［J］.果樹學(xué)報，2004，21（6）：615－617.

［8］ 桂騰琴，喬愛民，孫敏，等.果梅ISSR－PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化［J］.西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，29（10）：124－125.

［9］ 馬森.加拿大一枝黃花的入侵生物學(xué)研究［D］.上海：復(fù)旦大學(xué)，2003.

［10］張玉琴.外來入侵植物銀膠菊遺傳多樣性的ISSR分析［D］.南寧：廣西師范大學(xué)，2007.

［11］桂富榮.紫莖澤蘭的遺傳多樣性及其種群結(jié)構(gòu)分析［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2006.

［12］劉美.ISSR標(biāo)記的早熟禾遺傳多樣性分析［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［13］蓋鈞鎰.試驗統(tǒng)計方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：286－287.

［14］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)［M］.第2版.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：57－58.

［15］席嘉賓，鄭玉忠，楊中藝.地毯草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［J］.中山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，43（3）：80－84.

［16］歐文軍，李開綿，王文泉，等.小桐子基因組DNA的提取及ISSR－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（5）：409－413.

［17］王桂娟，陳茂盛，向振勇.小桐子ISSR－PCR體系的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通報，2008（3）：162－165.

［18］李海生.ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報，2004，39（2）：19－20.

［19］潘坤，王文泉，吳翼，等.椰子ISSR體系優(yōu)化［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（4）：24－29.

［20］姜靜，楊傳平，劉桂豐，等.樺樹ISSR－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2003，22（3）：91－93.

［21］曾黎輝，洪自同，許家輝，等.龍眼ISSR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（9）：111－113.

［22］謝運海，夏德安，姜靜，等.利用正交設(shè)計優(yōu)化水曲柳ISSRPCR反應(yīng)體系［J］.分子植物育種，2005，3（3）：445－450.

［23］Sánchez de la Hoz M P，Dávila J A，Loarce Y，et al.Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley［J］.Genome，1996，39：112－117.