炳嶺，李德龍，胡曉亮，劉在斯，秦立廷，吳 關(guān)，劉 文，祁小樂(lè)，王永強(qiáng)，高宏雷，高玉龍*，王笑梅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江哈爾濱150090)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，禽C性反轉(zhuǎn)錄病毒屬，可以引起禽類(lèi)多種腫瘤性疾病。該病在世界各地均有發(fā)生，感染率高，發(fā)病率低，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一[1]。目前，該病尚無(wú)徹底可行的防制措施，迄今為止尚無(wú)有效地疫苗，而預(yù)防該病的主要方法是培育具有遺傳性抵抗力的新品種，淘汰陽(yáng)性雞，凈化種群，經(jīng)過(guò)幾代選育出無(wú)白血病的雞群[2]。自2008年以來(lái)，蛋雞感染J亞群白血病病毒在國(guó)內(nèi)廣泛流行，并引起產(chǎn)蛋量下降[3-6]。自1868年，Roloff報(bào)道禽白血病以來(lái)，研究人員在病毒的分離、鑒定、檢測(cè)和診斷方面取得了一定的成就，建立了大量的檢測(cè)方法，如病毒中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA、放射免疫、免疫熒光技術(shù)等[7-8]。ALV的主要蛋白質(zhì)組分為gag基因編碼的核心蛋白、pol基因編碼的3種酶、env基因編碼的2種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，是一種高度保守的非糖基化蛋白，有許多病毒抗原位點(diǎn)，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本實(shí)驗(yàn)制備針對(duì)p27的單克隆抗體(MAb)，有助于ALV感染的檢測(cè)和病情監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞和血清 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B由哈爾濱獸醫(yī)研究所分離鑒定；DF-1、S/P20細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；兔抗天然p27蛋白陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 菌株及主要試劑 克隆載體pMD18-T、原核表達(dá)載體pET-30a、大腸桿菌DH5α和BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；T4DNA連接酶、IPTG、pMD18-T載體等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG、抗鼠熒光二抗、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司；1640培養(yǎng)基、HAT、HT購(gòu)自GibcoBRL；蛋白純化用填充材料購(gòu)自GE healthcare。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ALV-J株的序列[9]，采用軟件Primer prem ier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物p1、p2用于擴(kuò)增p27基因，上游引物P1：5'-CGGGATCCATG CCTGTAGTGATTAAGAC-3'，含有 Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。下游引物P2：5'-ACGTCGACCTAGGGCTGGAT AGCAGACG-3'，含有SalⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 DNA提取和p27基因的擴(kuò)增 將ALV-J接種于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DF-1細(xì)胞，7d后收集并凍融3次。采用DNA提取試劑盒從DF-1細(xì)胞凍融液中提取DNA。并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5m in；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10m in。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于pMD-18T載體后轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒，Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD-p27并測(cè)序。利用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒 pMD-p27和 pET-30a，分別回收720bp和4900bp片段，T4DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，小量提取質(zhì)粒，Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pET-p27。

1.6 p27蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測(cè) 挑取單個(gè)含有pET-p27的BL-21細(xì)菌菌落加入含Kna(100μg/m L)的LB中，37℃過(guò)夜振搖培養(yǎng)，次日擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm值約為0.8，加入IPTG至終濃度0.1mM，于37℃誘導(dǎo)6h，收獲細(xì)菌。離心后，將菌體用PBS重懸(50μL PBS/m L LB)，于4℃過(guò)夜后，超聲波裂解菌體，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析。按照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行純化，將純化的p27蛋白用兔抗天然p27蛋白陽(yáng)性血清進(jìn)行western blot分析。

1.7 動(dòng)物免疫 向純化的p27蛋白(2mg/m L)中加入等量的弗氏完全佐劑，乳化后皮下注射7周齡BLAB/c小鼠，每只0.05m L；21d后用含等量弗氏不完全佐劑的p27蛋白腹腔注射二次免疫，0.1m L/只，21d后僅用p27蛋白腹腔兼尾靜脈注射(0.05m L/只)加強(qiáng)免疫，3d后取脾臟用于融合。

1.8 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的建立 取免疫鼠脾臟制成細(xì)胞懸液與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S/P20細(xì)胞以8∶1的比例融合。待融合細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/2或1/3時(shí)，通過(guò)間接ELISA方法篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，再利用有限稀釋法連續(xù)克隆2次～3次。至陽(yáng)性率為100%后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存于液氮中。

1.9 p27MAb的制備 將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，以5×106/0.5m L雜交瘤細(xì)胞腹腔注射BLAB/C小鼠1m L，14d后待小鼠腹圍增大后收集腹水，1000r/min離心10min，上清以0.45μm濾器過(guò)濾后即為腹水MAb粗制品。

1.10 MAb的效價(jià)測(cè)定及亞類(lèi)的測(cè)定 將純化的p27蛋白作1∶1000稀釋包被酶聯(lián)反應(yīng)板，采用間接ELISA方法測(cè)定腹水中MAb效價(jià)，以P/N>2.5的最大稀釋度作為抗體的效價(jià)。采用免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定試劑盒檢測(cè)5株p27MAb的亞類(lèi)。操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.11 特異性鑒定

1.11.1交叉反應(yīng)鑒定將ALV-J、ALV-A、ALV-B、IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV 14種病毒根據(jù)蛋白含量的不同，稀釋至約15μg/m L，包被酶聯(lián)反應(yīng)板，間接ELISA檢測(cè)其與MAb的反應(yīng)，以DF-1細(xì)胞凍融離心后上清液作為陰性對(duì)照，PBS作為空白對(duì)照。OD450nm>0.2判定為陽(yáng)性。

1.11.2間接熒光免疫反應(yīng)鑒定將ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B接種于含DF-1細(xì)胞的24孔細(xì)胞板，將未接種病毒的DF-1作為陰性對(duì)照。5d后無(wú)水乙醇固定 15m in，并將 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做1∶200稀釋?zhuān)尤爰?xì)胞板孔內(nèi)，室溫孵育1h。PBST洗4次，抗鼠熒光二抗做1∶200稀釋避光室溫孵育1h，洗板后加入PBS，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-p27的鑒定 將pET-p27以Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，所得片段與預(yù)期相符，p27基因全長(zhǎng)720bp，編碼239個(gè)氨基酸殘基。

2.2 p27蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測(cè) 將表達(dá)蛋白在非變性條件下純化獲得His-p27融合蛋白，分子量約為34ku(圖1A)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兔抗天然p27蛋白陽(yáng)性血清進(jìn)行western blot分析，結(jié)果所表達(dá)的蛋白具有生物反應(yīng)活性(圖1B)。

2.3 陽(yáng)性雜交瘤株的建立 細(xì)胞融合率為89.4%，最終篩選出5株持續(xù)分泌抗ALV p27蛋白的MAb雜交瘤細(xì)胞株，編號(hào)分別是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。

2.4 MAb效價(jià)及亞類(lèi)的測(cè)定 采用已建立的ELISA方法對(duì) 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果分別為：27、210、29、27和28。免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定試劑盒測(cè)定5株MAb的結(jié)果顯示：2E5為IgG2b；3H8、4B7、6D9和10G2均為IgG1。

圖1 誘導(dǎo)表達(dá)p27蛋白的SDS-PAGE和western blot分析Fig.1SDS-PAGE(A)and western blot(B)analyse of p27protein

2.5 特異性鑒定 采用不同病毒對(duì)MAb進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV與5株MAb反應(yīng)的OD450nm值均小于0.15，并且 ALV-J、ALV-A、ALV-B與 5株 MAb反應(yīng)的OD450nm值均大于1.2。表明5株MAb有良好的特異性(圖 2)。分析熒光顯微鏡觀察 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和 10G2分 別 與 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B呈陽(yáng)性反應(yīng)，呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，而陰性對(duì)照無(wú)綠色熒光(圖3)。

圖2 特異性鑒定Fig.2Identification of the specificity of p27MAb

3 討論

圖3 MAb間接熒光免疫反應(yīng)分析結(jié)果Fig.3IFA analysis for p27monoclonal antibody

禽白血病主要危害有兩個(gè)方面，一是產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞死亡；二是引起母雞產(chǎn)蛋率下降、蛋重減輕等生產(chǎn)指標(biāo)的改變；另外還能夠引起雞的免疫抑制，繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒的感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1997年和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。近些年來(lái)，在國(guó)內(nèi)許多省份，ALV-J主要感染15周～29周齡蛋雞，引起產(chǎn)蛋量顯著下降，趾骨周?chē)つw和羽毛處淋巴結(jié)出血[6]。

本實(shí)驗(yàn)將ALV p27在BL21E.coli中表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，并且省去了傳統(tǒng)方法通過(guò)提純病毒、去污劑裂解、電泳提純目的蛋白的繁瑣步驟[12-13]。其表達(dá)載體pET-30a是一種高效的融合HIS標(biāo)簽的原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白，采用親和層析法純化，從而獲得高純度的目的蛋白，為下一步特異性MAb的獲得奠定了基礎(chǔ)。

在p27MAb制備過(guò)程中，本研究采用原核表達(dá)的p27蛋白作為免疫原，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、篩選及克隆化，最終制備了5株針對(duì)p27的MAb。其效價(jià)高達(dá)107以上，并且分泌抗體穩(wěn)定、特異性高。5株MAb與常見(jiàn)的外源性ALV-J、ALV-A、ALV-B[14]反應(yīng)特異，能夠觀察到明顯的熒光，而與DF-1不反應(yīng)，為禽白血病的診斷、防控和凈化奠定了基礎(chǔ)。

本研究為p27蛋白抗原決定簇的研究和ALV在病原學(xué)、血清學(xué)、組織化學(xué)和基因表達(dá)等方面的研究提供了有力工具；為禽白血病ELISA抗原診斷試劑盒研制奠定了基礎(chǔ)。

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