彭云武，楚 渠

(安康學(xué)院，陜西 安康 725000)

野桑蠶 (Bombyx mandarina)是一種與家蠶親緣關(guān)系最近的野生資源，蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息，是家蠶品種選育的寶貴材料［1］。1999年后，SSR分子標(biāo)記在家蠶資源的遺傳多樣性分析、基因作圖、基因定位、品種鑒定和標(biāo)記輔助育種等方面進(jìn)行了應(yīng)用［2－6］。在農(nóng)作物方面，鐘昌松等［7］用 SSR標(biāo)記對普通玉米和特用玉米進(jìn)行聚類分析，王海燕等［8］利用SSR標(biāo)記分析云南、西藏和新疆小麥的遺傳多樣性，王凱華等［9］用 SSR標(biāo)記分析甘藍(lán)型油菜種質(zhì)遺傳多樣性，邱紅波等［10］用SSR標(biāo)記對貴州玉米種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，宗緒曉等［11］利用SSR標(biāo)記分析中國豌豆地方品種遺傳多樣性，吳曉雷等［12］用SSR標(biāo)記研究大豆屬種間親緣進(jìn)化關(guān)系，張真真等［13］對矮化佛手的遺傳差異進(jìn)行SSR分析。作者用SSR標(biāo)記對家蠶 ×野桑蠶后代群體進(jìn)行親緣關(guān)系與遺傳多態(tài)性的研究，為野桑蠶資源利用和家蠶雜交育種親本的選配及雜種后代的預(yù)選提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的26份材料 (表1)中有家蠶品種2個(gè)，分別是874和873;野桑蠶品種4個(gè)，分別是CS6、Bh1、Bh2、Tb2;栗蠶材料1個(gè);其余的為家蠶×野桑蠶的品種組合。采用在公開期刊上發(fā)表的應(yīng)用于家蠶的SSR引物序列［14］(表2－3)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。TaqDNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物公司。

表1 供試材料的類型及來源

表2 SSR(Chr 1－15)引物的名稱、序列及大小

表3 SSR(Chr 16－28)引物的名稱、序列及大小

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法進(jìn)行提取。在65℃水浴鍋中預(yù)熱CTAB提取液;每供試材料取雙翅在液氮中迅速研磨，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預(yù)熱的CTAB提取液 (每克樣品加入3～5 mL的提取液)，65℃保溫30～60 min，每隔10 min輕輕顛倒混勻;12 000 r·min－1離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;加入等體積酚/氯仿 (1∶1)，充分混勻，12 500 r·min－1離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;加入等體積氯仿，充分混勻，12 500 r·min－1離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管;重復(fù)加入酚/氯仿和氯仿的步驟;加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15 min;12 000 r·min－1離心6 min，棄上清;將沉淀用70%的乙醇漂洗1次，室溫下12 500 r·min－1離心 2 min，棄上清，重復(fù)洗1次;提取產(chǎn)物取2～3 μL用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物檢測及退火

以1號樣本為模板，分別選擇 45.8，49.1，53.7，62.5和65℃作為退火溫度，根據(jù)檢測結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)給出建議退火溫度，并從100對SSR引物中篩選出能夠有效擴(kuò)增的引物為初篩合格引物。再選取其中擴(kuò)增效果好、條帶差異明顯、重復(fù)性好、信號強(qiáng)、背景清晰的引物在26份不同類型材料間進(jìn)行SSR-sPCR反應(yīng)。

1.3 PCR反應(yīng)和電泳

PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，其中 ddH2O 7.2 μL，2 × PCRMix 10 μL，正向引物 0.3 μL，反向引物 0.3 μL，DNA 2 μL，Taq酶 0.2 μL PCR擴(kuò)增程序:94℃ 4 min→ (94℃35 s;62.5℃35 s;72℃50 s)×35個(gè)循環(huán)→72℃10 min→4℃后取出擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)完成后每個(gè)反應(yīng)體系中加入10 μL裝載染料。電泳緩沖液為1×TBE，電流50 mA，電泳時(shí)間為75 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每一對SSR引物電泳后將在特定位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，將凝膠成像系統(tǒng)中成像圖片掃描并數(shù)擴(kuò)增帶數(shù)。同一標(biāo)記在不同材料中擴(kuò)增出來的條帶，在某一位置有帶存在記為1，沒有的則記為0。用浙江大學(xué)開發(fā)的DPS v7.05版統(tǒng)計(jì)軟件中的子程序多元分析，選聚類分析，再選0，1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類，聚類距離選Nei-Li(Czekanoeki);聚類方法選類平均法 (UPGMA)，得出遺傳距離和聚類樹形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

以1號樣本為模板，引物檢測的結(jié)果是擴(kuò)增好的81對，擴(kuò)增不太好的11對，沒有擴(kuò)增的8對。經(jīng)瓊脂糖檢測獲得69對擴(kuò)增比較好的引物進(jìn)行PAGE檢測 (圖1)。

圖1 引物的PAGE檢測結(jié)果

2.2 DNA的多態(tài)性分析

采用69對引物對表1所列品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得2 529個(gè)多態(tài)性片段，平均每對引物擴(kuò)增出等位片段36.6個(gè) (圖2)。等位片段數(shù)最多的為S0105，共有113個(gè)，等位片段數(shù)最少的為S1706和 S2707，均為21個(gè)。各品種的擴(kuò)增帶從23～115條不等。由此可見不同引物、不同品種之間的多態(tài)性各不相同。

圖2 引物S2215的擴(kuò)增情況

2.3 親緣關(guān)系的聚類分析

用69對引物對26個(gè)材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將各引物的擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化為0，1數(shù)據(jù)，利用浙江大學(xué)的DPS v7.05版統(tǒng)計(jì)軟件中的Nei-Li(Czekanoeki)方法計(jì)算各品種間的遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析，得到如圖3所示的樹狀。

圖3 家蠶、野桑蠶及其它們雜交后代SSR分析的遺傳關(guān)系

研究結(jié)果顯示，26個(gè)材料中最先聚在一起的是Ak11051(野蠶斑)和Ak11051(普斑)，即幼蟲斑紋不同的同一品種，說明所選SSR標(biāo)記引物足以區(qū)分親緣關(guān)系很近的不同材料。26個(gè)試驗(yàn)材料之間的遺傳距離最小的為0.110 9，最大為1.918 3，表明供試材料具有豐富的遺傳多樣性。

根據(jù)SSR分子標(biāo)記聚類分析可知，供試的26個(gè)材料分為明顯的4個(gè)大類群:第1大類群為栗蠶;第2大類群有Bh1和CS6野桑蠶材料;第3大類群Tb1和Tb2野桑蠶材料，表明同一區(qū)域內(nèi)的野桑蠶的親緣關(guān)系較近;第4大類群又按品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近分為2大亞類，即與家蠶873遺傳性狀相近的聚為1個(gè)亞類、與家蠶874遺傳性狀相近的聚為另1個(gè)亞類。

3 小結(jié)與討論

雜交育種是選育新品種的主要途徑，也是近代家蠶育種工作的重要方法。本研究所用材料是家蠶×野桑蠶雜交所得的后代群體，變異類型豐富，為培育家蠶新品種提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究選用了69對家蠶SSR引物對26種供試材料基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。聚類結(jié)果表明，SSR標(biāo)記可以完全鑒別出本試驗(yàn)中的家蠶的兩大系統(tǒng)，這與郭秋紅等［15－16］用 SSR標(biāo)記對家蠶品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析得到的結(jié)果基本一致。

白河野桑蠶與漢濱野桑蠶各聚一類，試驗(yàn)結(jié)果印證了白河野桑蠶是一個(gè)與其他野桑蠶材料遺傳差異大的野桑蠶［17］。所以，微衛(wèi)星標(biāo)記能較為客觀地反映不同地方野桑蠶的遺傳關(guān)系。

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