胡興勝 付曦 文世民 鄒心怡 劉雨松

目前，肺癌死亡率已位居男、女性惡性腫瘤的第一位[1]，全球每年至少有160萬的新發(fā)病例和130萬的死亡病例。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%。侵潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征之一，亦是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。肺癌易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，其5年生存率低。目前有關(guān)肺癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚，因此探索與肺癌浸潤轉(zhuǎn)移尤其是與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，顯得尤為重要。研究[2]表明，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis-associated in colon cancer 1, MACC1）是2009年新發(fā)現(xiàn)的，能夠預(yù)測腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的新基因，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF，又稱離散因子）及其受體c-met表達(dá)有關(guān)。為此，我們采用免疫組化聯(lián)合檢測了MACC1和c-met在NSCLC組織中的表達(dá)情況，并分析了它們與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2003年1月-2006年1月在川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院胸心外科手術(shù)標(biāo)本103例和同期40例距離癌腫邊緣5 cm以上的正常組織。所有患者術(shù)前均未化療或放療，有完整的臨床資料和明確的術(shù)后病理診斷。其中男性77例，女性26例；＜60歲51例，≥60歲52例；不吸煙42例，吸煙61例；鱗癌56例，腺癌47例；高分化15例，中分化68例，低分化20例；T1期+T2期78例，T3期+T4期25例；N0期70例，N1,2,3期33例；I期56例，II期12例，III期35例。

隨訪：所有患者每3個月均進(jìn)行電話、門診或住院部隨訪，隨訪開始于2003年4月，2011年1月結(jié)束，最短隨訪時間為4個月，最長隨訪時間為5年。期間有9例失訪。

1.2 免疫組化檢測MACC1和c-met蛋白的表達(dá) 手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度4 μm。采用免疫組化SP法（兔抗人MACC1多克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗人c-met多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化二抗SP試劑盒購自北京中杉生物公司）。用PBS液代替一抗作為陰性對照，按照試劑說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判斷：所有切片均采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨立閱片。MACC1和c-met陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，呈淺黃色、黃色或棕黃色。隨機(jī)選擇10個高倍鏡視野（400倍），每個視野連續(xù)計數(shù)100個細(xì)胞，共計數(shù)1,000個細(xì)胞。最后表達(dá)以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率的得分之和進(jìn)行判斷：無染色記0分，弱染色記1分，中等染色記2分，強(qiáng)染色記3分；陽性細(xì)胞率＜5%記0分，5%-25%記1分，26%-50%記2分，＞50%記3分。上述兩項評分相加，＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件包分析。率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗，多因素生存分析采用Cox多因素分析模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACC1和c-met蛋白檢測結(jié)果 MACC1和c-met在癌組中的陽性率分別為67.9%（70/103）和68.9%（71/103），均明顯高于其在正常組織中的表達(dá)5.0%（2/40）（χ2=45.684, P＜0.001）和7.5%（3/40）（χ2=43.545, P＜0.001）（圖1）。

2.2 MACC1蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的聯(lián)系 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，MACC1和c-met的陽性率均隨腫瘤分化程度的降低、T分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的增加而增加（P＜0.05），而與性別、年齡、吸煙及組織學(xué)類型等無關(guān)（P＞0.05）（表1）。

2.3 MACC1和c-met相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在103例肺癌組織中MACC1和c-met的表達(dá)呈正相關(guān)，（r=0.403, P＜0.001）。

2.4 生存分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示，MACC1陽性組的5年生存率為19.5%，明顯低于陰性組的59.9%（χ2=15.093, P＜0.001）。c-met陽性組5年生存率為25.4%，明顯低于陰性組的48.3%（χ2=8.230, P=0.004）（圖2）。

2.5 Cox多因素回歸分析 Kaplan-Meier單因素分析發(fā)現(xiàn)，分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均與患者的生存期相關(guān)，故均納入Cox多因素分析模型。Cox多因素分析結(jié)果顯示，只有MACC1（P=0.026）和TNM分期（P=0.004）是肺癌患者的獨立預(yù)后危險因素，其相對危險度（relative risk, RR）分別為2.178（95%CI:1.097-4.327）和2.230（95%CI: 1.288-3.860），而c-met表達(dá)不是患者的獨立危險因素（P＞0.05）（表2）。

3 討論

MACC1基因定位于人染色體7p21.1。該基因是2009年由Stein等[2]發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因，研究表明它與結(jié)腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。Stein檢測到MACC1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)異常增高，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例中其表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移者，MACC1高表達(dá)者5年生存率為15%明顯低于低表達(dá)者的80%，且是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)后指標(biāo)。后來研究表明，MACC1在胃癌[3]、肝癌[4-5]、卵巢癌[6]、肺腺癌[7]、前列腺癌[8]等腺癌組織及膀胱移行細(xì)胞癌[9]、腦膠質(zhì)瘤[10]、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系[11]等非腺癌組織中過表達(dá)，并且與浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MACC1高表達(dá)的肝癌組患者總生存率和無病生存率均明顯低于低表達(dá)組[5]。在肺癌的研究中，Chundong等[7]采用免疫組化方法對197例手術(shù)后肺腺癌患者研究結(jié)果顯示，MACC1的陽性率為65.5%，在復(fù)發(fā)組中的陽性率為82.5%（33/40），明顯高于非復(fù)發(fā)組的61.1%（96/157），陽性組無病生存期較陰性組降低。楊淑慧等[11]觀察到MACC1在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，用MACC1 siRNA抑制其表達(dá)后，能明顯抑制癌細(xì)胞的增殖遷移能力。

圖 1 免疫組化檢測MACC1在肺鱗癌（A）和腺癌（B）以及c-met在肺鱗癌（C）和腺癌（D）組織中的陽性表達(dá)（×400）Fig 1 The positive expression of MACC1 in lung squamous carcinoma (A) and adenocarcinoma (B), c-met in lung squamous carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) tissue by immunohistochemistry (×400).

圖 2 Kaplan-Meier累計生存時間曲線分析。A：MACC1表達(dá)陽性和陰性NSCLC患者；B：c-met表達(dá)陽性和陰性NSCLC患者。Fig 2 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A: MACC1 positive and negative expression group of NSCLC petients; B: c-met positive and negative expression group of NSCLC petients; NSCLC:non-small cell lung cancer.

HGF是一種多功能細(xì)胞活性因子，具有很強(qiáng)的促有絲分裂作用，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)生離散和運動。c-met是由原癌基因編碼的HGF受體，主要在各種上皮細(xì)胞中表達(dá)。c-met編碼了酪氨酸激酶，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲性生長。HGF須與c-met受體結(jié)合方能發(fā)揮作用，兩者結(jié)合導(dǎo)致兩個酪氨酸殘端在羧基端的磷酸化，引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的酶促反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的生物學(xué)行為，如細(xì)胞的運動等。正常的HGF/c-met通路在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育及組織損傷修復(fù)，而異常激活促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。HGF/c-met在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，并且與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[12,13]。

MACC1是HGF/c-met信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。c-met已被證明是MACC1的轉(zhuǎn)錄子靶點[2]，它能通過擴(kuò)增和（或）變異而不依賴與HGF的結(jié)合來激活。MACC1調(diào)節(jié)c-met的機(jī)制，可能是與c-met啟動子區(qū)的SP1位點結(jié)合，從而激活c-met，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。HGF與c-met結(jié)合后，能啟動下游3條信號途徑：①磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）；②信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）；③有絲分裂原活化激酶（MAPK）。這3條通路是細(xì)胞核內(nèi)主要轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)，從而促使腫瘤細(xì)胞增殖、運動、浸潤、轉(zhuǎn)移及血管生成等。另外，MACC1還可通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)[8]等方面，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。

表 1 MACC1和c-met的表達(dá)與NSCLC的臨床病理特征聯(lián)系Tab 1 Correlation of MACC1 and c-met expression with clinicopathologic characteristics of NSCLC

表 2 Cox方程中的變量Tab 2 Cox variables in the Equation

本研究結(jié)果顯示，MACC1和c-met蛋白均在NSCLC組織中呈過表達(dá)。雖然文獻(xiàn)多數(shù)報道MACC1在腺癌中高表達(dá)，但本研究首次報道了其在鱗癌組織中的高表達(dá)，與腺癌組織中的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與MACC1（與c-met相關(guān)）在腫瘤的發(fā)展過程中普遍起作用相關(guān)，這已在膀胱癌[9]、腦膠質(zhì)瘤[10]、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系[11]非腺癌中得到證實。本研究表明，MACC1和c-met蛋白的異常表達(dá)均與肺癌的分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報道基本一致。T分期是腫瘤體積的大小和侵襲能力的綜合反應(yīng)，提示MACC1參與了腫瘤的分化、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。本研究中MACC1和c-met的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.403, P＜0.001），與Zhang[6]在卵巢癌中的報道（r=0.429, P=0.002）基本一致，但高于Qiu[5]在肝癌中對兩者mRNA檢測的報道（r=0.235, P=0.009），導(dǎo)致這種差異可能與腫瘤的類型、蛋白/mRNA檢測的差異及樣本量有關(guān)。本研究生存分析顯示，MACC1和c-met的高表達(dá)均預(yù)示肺癌的不良預(yù)后，其中MACC1是肺癌獨立預(yù)后危險因素，這與Stein[2]在結(jié)腸癌、Qiu[5]在肝癌及Chundong[7]在肺腺癌中的報道基本一致，提示MACC1可能是腫瘤的一個重要獨立預(yù)后分子指標(biāo)。

綜上所述，我們的研究揭示了MACC1和c-met均在肺癌組織中過表達(dá)，其表達(dá)與肺癌的分化、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，它們對生存期均有一定的影響，而MACC1可能是肺癌的一項新的獨立預(yù)后指標(biāo)。因此，通過檢測MACC1和c-met的表達(dá)可以更好的判斷肺癌的惡性程度和預(yù)后，設(shè)想通過抑制MACC1的表達(dá)，抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等，改善肺癌的不良預(yù)后，為腫瘤的靶向治療提供新的靶點，為腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。