劉媛媛，張小里，姚 娜，李紅亞，趙彬俠

（西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069）

磷脂酶D的紫外誘變選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉媛媛，張小里，姚 娜，李紅亞，趙彬俠

（西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069）

磷脂酶D在催化磷脂?；粨Q反應(yīng)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文對產(chǎn)磷脂酶D野生鏈霉菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選得到一株產(chǎn)酶活力提高42.5%的變異株。通過搖瓶培養(yǎng)，對發(fā)酵條件進(jìn)行探究。確定的最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10.0 g/L，牛肉膏和蛋白胨各5.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl23.0 g/L，NaCl 2.0 g/L；表面活性劑Tween80對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其適宜濃度為0.60 g/L。在上述條件下，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶活力達(dá)3.23 U/mL。

磷脂酶D；誘變；磷脂?；D(zhuǎn)移；發(fā)酵

磷脂酶D（phospholipase D，EC3.1.4.4，簡稱PLD)，即磷脂酰膽堿水解酶，能催化水解卵磷脂（PC）釋放出磷脂酸和膽堿，在醇類物質(zhì)存在下，一些PLD亦能催化磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，將具有羥基的底物與膽堿的極性頭部進(jìn)行交換反應(yīng)，生成新磷脂[1-3]。PLD催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)可合成許多稀有或半合成磷脂，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。據(jù)報(bào)道，稀有鏈霉菌株是磷脂?；D(zhuǎn)移活力PLD主要生產(chǎn)菌，然而，野生菌株的酶產(chǎn)量普遍很低[4]。

本工作利用前期篩選得到的一株產(chǎn)磷脂酰基轉(zhuǎn)移活力 PLD野生鏈霉菌株，通過紫外誘變篩選育種，改良菌株的產(chǎn)酶能力；并且，對所篩選高產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶D的最佳工藝條件進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

磷脂酶D產(chǎn)生菌Streptomyces PLD0606，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

孢子萌發(fā)培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉 10.0；蛋白胨 10.0；CaCl2，0.01 mol/L。

PDA 培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200.0；葡萄糖20.0；瓊脂 20.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10.0；蛋白胨 7.5；酵母浸膏 20.0；K2HPO42.0；MgSO4·7H2O 0.5；pH值 6.8～7.2。當(dāng)探索最佳條件時，組分及濃度進(jìn)行必要調(diào)整。

1.1.3 試 劑

薄層層析硅膠板（GF254），青島海洋化工集團(tuán)；瓊脂粉（BR），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨（BR），天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷脂酰基對硝基酚（p-PNP）為本實(shí)驗(yàn)室合成。其它試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單孢子懸液的制備

原始菌株于 PDA斜面培養(yǎng)基上 28 ℃培養(yǎng) 7天，無菌水洗孢子，轉(zhuǎn)至帶玻璃珠的試管充分震蕩，濾紙過濾。調(diào)整孢子濃度為107個/mL數(shù)量級。

1.2.2 孢子預(yù)萌發(fā)及誘變劑量的確定

將1 mL單孢子懸液加入到裝有5 mL萌發(fā)培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床培養(yǎng)，經(jīng)過0、2 h、4 h、6 h后分別取樣，于培養(yǎng)皿中紫外線照射2 min測算孢子致死率。結(jié)果表明培養(yǎng)4 h的孢子懸液對紫外線最敏感，最適宜紫外線處理。在相同條件下制備敏感孢子懸液，紫外線照射一定時間后，暗培養(yǎng)7天后，統(tǒng)計(jì)致死率，確定適宜的誘變劑量。

1.2.3 誘變處理

按照上述方法處理，采取先紫外照射30 s，然后置于日光燈下光修復(fù)30 min，再在紫外燈下照射90 s。28 ℃避光培養(yǎng)3天后，再取出正常培養(yǎng)4天。

1.2.4 突變株的篩選

從培養(yǎng) 7天的誘變平板上挑選單菌落接種斜面，培養(yǎng)后，搖瓶發(fā)酵測定PLD水解活力進(jìn)行初篩；測定磷脂酰基轉(zhuǎn)移活力進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.5 傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)

將突變株進(jìn)行連續(xù)傳代，測定PLD發(fā)酵水平，并以第一代為基準(zhǔn)進(jìn)行相比較。

1.2.6 PLD活力測定

PLD水解活力以p-PNP為底物依分光光度法測定[2]。磷脂?；D(zhuǎn)移活力以 PC轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺（PE）的反應(yīng)測定，PC及PE濃度以氯仿-甲醇-水（13:5:0.8，體積比）為展開劑、GF254硅膠板TLC測定；碘蒸氣染色的薄層板用圖像處理軟件測量斑點(diǎn)面積及灰度值，計(jì)算出磷脂組分濃度。酶蛋白質(zhì)濃度依 Bradford法以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定[5]，并用于PLD比活力測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變劑量

鏈霉菌PLD0606經(jīng)過紫外線照射不同的時間，在28 ℃下培養(yǎng)7天后，統(tǒng)計(jì)其致死率，結(jié)果見表1。由表1可見，致死率隨紫外線照射時間加長而增加，90～120 s時致死率達(dá)90%左右。故選擇紫外線照射120 s作為適宜的誘變劑量，此時的正突變率一般較高。

表1 鏈霉菌紫外誘變致死率

2.2 突變株的篩選

如表2所示，挑取經(jīng)過紫外誘變的不同形態(tài)單菌落接種斜面，發(fā)酵測試酶產(chǎn)量進(jìn)行初篩和復(fù)篩。發(fā)現(xiàn)與原始菌落（編號 0）形狀相同、但孢子飽滿的變異株P(guān)LD產(chǎn)量顯著增加。菌落形態(tài)均呈梅花褶皺型，但變異株產(chǎn) PLD磷脂酰基轉(zhuǎn)移活力提高約42.5%。

2.3 傳代穩(wěn)定性結(jié)果

傳代試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，表明此突變株具有較為穩(wěn)定的遺傳性能，高產(chǎn)磷脂酶D性能在菌株傳代保藏和培養(yǎng)發(fā)酵過程中不易丟失，具有應(yīng)用價(jià)值。

表2 紫外誘變結(jié)果

表3 傳代次數(shù)與相對酶活的關(guān)系

2.4 氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已確定適宜碳源為葡萄糖10.0 g/L的基礎(chǔ)上，研究牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、花生粉、黃豆粉等常見復(fù)合氮源對變異株產(chǎn) PLD的影響。選擇牛肉膏15.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，牛肉膏、蛋白胨各7.5 g/L時，菌絲生長情況及酶活力如表4所示。在相同濃度下，不同的天然有機(jī)氮源對鏈霉菌產(chǎn)酶影響效果并不顯著，均能被鏈霉菌充分利用，其菌絲生長情況良好。當(dāng)選用牛肉膏+蛋白胨復(fù)合有機(jī)氮源時，酶活力比用單一氮源牛肉膏或蛋白胨時有所提高，但提高效果并不明顯。

圖1描述了牛肉膏、蛋白胨作混合氮源時，其濃度對PLD相對活力的影響。在用量均為5.0 g/L時相對酶活力達(dá)到最大。

2.5 無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它組分不變，分別對CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl三種無機(jī)鹽進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖2所示，三種無機(jī)鹽均對產(chǎn)酶有顯著影響，當(dāng) CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl濃度分別達(dá)到為 3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L時產(chǎn)酶效果最好。

表4 不同天然氮源對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖1 氮源濃度對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖2 不同種類無機(jī)鹽濃度對鏈霉菌產(chǎn)酶的影響

2.6 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

表面活性劑能改變細(xì)胞膜透過性，從而有利于胞內(nèi)酶擴(kuò)散至培養(yǎng)基中。本文選用Tween 60、Tween 80、PEG 2000、Span五種表面活性劑試驗(yàn)對鏈霉菌產(chǎn)酶的影響，其濃度均為0.2 g/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3所示。由圖3可以看出，Span和Tween 80對鏈霉菌產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用，而Tween 80的作用較為明顯。

圖4即顯示不同Tween 80濃度對鏈霉菌產(chǎn)酶的影響。由圖4可知，當(dāng)Tween 80達(dá)到最佳的添加劑量0.6 g/L時，PLD相對活力最大。而后，當(dāng)繼續(xù)加大表面活性劑的用量時，酶活力基本不變。

適宜氮源、無機(jī)鹽濃度下，結(jié)合表面活性劑作用，本文搖瓶發(fā)酵最好水平對應(yīng)的PLD活力達(dá)3.23 U/mL。

3 結(jié) 論

圖3 表面活性劑種類對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 Tween80不同濃度對鏈霉菌產(chǎn)酶的影響

通過紫外誘變改良，得到一株P(guān)LD高產(chǎn)菌株，酶活力相較原始菌株提高了約42.5%，傳代穩(wěn)定性良好。對變異株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基成分對產(chǎn)酶效果有一定影響。天然氮源牛肉膏與蛋白胨等量配合，濃度各為5.0 g/L時產(chǎn)酶效果較好；無機(jī)鹽 CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl，濃度分別為3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L效果較佳；表面活性劑Tween80對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其適宜濃度為0.6 g/L。優(yōu)化條件下，搖瓶發(fā)酵磷脂酶D活力達(dá)到3.23 U/mL。

[1] 陳石良，許正宏，孫微.磷脂酶D的研究進(jìn)展[J].工業(yè)微生物，1999，29（4）：47-50.

[2] Paola D，Arrigo，Valentino Piergianni，et al. A spectrophotometric assay for phospholipase D[J].Analytica Chimica Acta，1995，304（2）：249-254.

[3] Paola D，Arrigo，Trefano Sevi. Using phospholipases for phospholipids modification[J]. Tibth March，1997，15（3）：90-96.

[4] Yoshiko Uesugi，Tadashi Hatanaka. Phospholipase D mechanism using Streptomyces PLD[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1791（9）：962-969.

[5] Tsaffrir Z，Selinger Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity：Theoretical and experimental studies[J].AnalyticalBiochemistry，1996，236：302-308.

Ultraviolet mutagenesis breeding and fermentation conditions of phospholipase D producing strain

LIU Yuanyuan，ZHANG Xiaoli，YAO Na，Li Hongya，Zhao Binxia
（School of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China）

Phospholipase D (PLD) catalyzed transphosphatidylation reaction plays an important and useful role in synthesis of phospholipids. In the present paper，a PLD-high-producing strain was selected by ultraviolet mutagenesis from wild Streptomyces and its PLD activity was increased by 42.5% against the original strain. The PLD producing conditions for the mutant strain was investigated in shake flask fermentation. The optimized components (g/L) of culture medium were 10.0 of glucose，5.0 of beef extract，5.0 of peptone，1.0 of MgSO4·7H2O，3.0 of CaCl2，and 2.0 of NaCl. The enzyme productivity could also be enhanced by the supply of surfactant i.e. Tween 80，and its optimal concentration was 0.6 g/L. Under the above conditions，3.23 U/mL of enzyme activity was achieved in 500 mL of shake flask fermentation.

phospholipase D；mutagenesis；transphosphatidylation；fermentation

TQ 925+9

：A

：1000-6613（2012）09-2036-04

2012-04-16 ；修改稿日期：2012-05-11。

陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃（2004K08-C24）及陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（04JC05）。

劉媛媛（1987—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：張小里，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锎呋^程、催化反應(yīng)工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。