丁 鶯 呂 賓 孟立娜 范一宏 沈 雁

杭州市下沙醫(yī)院急診科1(310018) 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科2

腸易激綜合征(IBS)是一種常見的胃腸功能紊亂性疾病，西方國(guó)家人群的患病率高達(dá)10% ～20%［1］;我國(guó)城市居民患病率為 10.50%，鄉(xiāng)村為6.14%［2］。一項(xiàng)韓國(guó)研究［3］顯示IBS相關(guān)癥狀可對(duì)患者的健康相關(guān)生活質(zhì)量(HRQOL)產(chǎn)生重大影響，對(duì)社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。IBS的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與腸道動(dòng)力、分泌、感覺等異常相關(guān)［4］。蛋白質(zhì)組學(xué)能從組織臟器整體水平上動(dòng)態(tài)定量地觀察疾病過(guò)程中蛋白質(zhì)的改變，有助于探尋疾病的發(fā)病機(jī)制。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察痛瀉要方對(duì)內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸黏膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，旨在從分子水平探討痛瀉要方對(duì)IBS起效的可能作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)成年雌性Sprague－Dawley(SD)大鼠24只，體質(zhì)量約200 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK(浙)2008－003。于室溫22～24℃、濕度 ＜60%、噪音 ＜50 dB的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，正常飲水?dāng)z食。

2.痛瀉要方煎劑制備:按成人體質(zhì)量60 kg，痛瀉要方包括炒白術(shù)15 g、炒白芍12 g、防風(fēng)10 g、陳皮6 g。大鼠用藥量以成人單位體質(zhì)量的6.25倍計(jì)算。取生藥顆粒劑，以蒸餾水作為溶劑，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓渲蒙帩舛? g/mL，40℃避光保存，置于避光飲水瓶中。按生藥4.5 g·kg－1·d－1，即痛瀉要方煎劑4.5 mL·kg－1·d－1給藥，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。

3.主要試劑:考馬斯亮藍(lán) R－250、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、瓊脂糖、甘油、溴酚藍(lán)、3－(3－膽酰胺丙基)二甲氨基－1－丙磺酸(CHAPC)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碘乙酰胺(IAA)、固相pH梯度(IPG)膠條(pH 3～10)和Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司;硫脲購(gòu)自美國(guó)Fluka公司;通用蛋白酶抑制劑混合物(PIC)購(gòu)自瑞士Roche公司;CyDye熒光染料試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司;賴氨酸購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;Milli－Q水購(gòu)自于美國(guó)Millipore公司;兔抗鼠/人二硫鍵異構(gòu)酶結(jié)合蛋白(PDIA3)多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;羊抗兔多克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細(xì)胞裂解液自行配制，內(nèi)含Tris 30 mmol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPC，以 HCl調(diào)整pH值為8.5。重泡漲液自行配制，內(nèi)含尿素7 mol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPS、1%IPG 緩沖液、DTT 40 mmol/L、痕量溴酚藍(lán)。膠條平衡液自行配制，內(nèi)含尿素180 g、十二烷基硫酸鈉(SDS)10 g、TrisCl(pH 8.8)16.75 mL、甘油 150 mL，以 Milli－Q水定容至500 mL。

4.主要儀器:Ettan IPGphorⅡ型等電聚焦儀和Ettan DALTsix大規(guī)模垂直電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司;Typhoon 9410多功能激光掃描成像系統(tǒng)、全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)Ettan Spot Picker和自動(dòng)質(zhì)譜點(diǎn)樣系統(tǒng) Ettan Spotter購(gòu)自美國(guó) Amersham Biosciences公司;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4800 Plus MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀)購(gòu)自美國(guó)ABI公司;400R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司。

二、方法

1.動(dòng)物分組和造模方法:24只大鼠順序編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和治療組，每組各8只?？瞻讓?duì)照組大鼠在正常條件下飼養(yǎng)，后兩組參照晁冠群等［5］的方法，以樟腦丸特殊氣味作為條件刺激，結(jié)直腸擴(kuò)張結(jié)合經(jīng)典的肢體束縛作為非條件刺激，建立內(nèi)臟高敏感模型。將大鼠裝入放有樟腦丸的應(yīng)激籠，用膠布固定四肢和軀干45 min，限制自由運(yùn)動(dòng)，但可作少許前后活動(dòng)和回頭。固定后將氣囊導(dǎo)管經(jīng)肛門插入直腸，氣囊遠(yuǎn)端距肛門口約1 cm，并固定于鼠尾。氣囊內(nèi)壓力＞60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，以間斷充氣法行結(jié)直腸擴(kuò)張，每次充氣1.6 mL，持續(xù)60 s，以3 min的間隔重復(fù)充氣10次，完成1次應(yīng)激程序。第1 d完成1次應(yīng)激程序后放回原飼養(yǎng)環(huán)境，第2 d同一時(shí)間給予同樣應(yīng)激程序1次，第4 d給予條件刺激45 min，第5 d重復(fù)應(yīng)激程序，第6、8 d給予條件刺激45 min，第3、7 d正常喂養(yǎng)。模型制備成功后，各組給予不同的藥物干預(yù)?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組大鼠均以 0.9%NaCl溶液 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，治療組以痛瀉要方煎劑 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，連續(xù)4周。

2.模型驗(yàn)證方法:實(shí)驗(yàn)第14 d，將石蠟油潤(rùn)滑后的8F導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入，將球囊末端置于距離肛門1.0 cm處，用棉線將導(dǎo)尿管固定于大鼠尾巴根部。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，逐漸注水使球囊擴(kuò)張，行大鼠腹壁回撤反射(AWR)評(píng)分。AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分，大鼠對(duì)結(jié)直腸擴(kuò)張無(wú)行為學(xué)反應(yīng);1分，結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí)身體靜止不動(dòng)，頭部運(yùn)動(dòng)減少;2分，結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮，但腹部未抬離桌面;3分，結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮并抬離桌面;4分，結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí)骨盆抬起，身體呈弓形。記錄AWR評(píng)分為3分時(shí)所需的注水量。每次結(jié)直腸擴(kuò)張持續(xù)30 s，重復(fù)進(jìn)行3次，取均值。

3.干預(yù)后內(nèi)臟敏感性評(píng)估:實(shí)驗(yàn)第43 d，對(duì)各組動(dòng)物行直腸注水?dāng)U張實(shí)驗(yàn)，采用AWR評(píng)分評(píng)估大鼠內(nèi)臟敏感性，具體操作方法同前。

4.大鼠結(jié)腸黏膜組織蛋白質(zhì)樣品的制備:實(shí)驗(yàn)第45 d，大鼠腹腔注射10%水合氯醛深麻醉處死，取距回盲部約2 cm的結(jié)腸1塊，按100 mg樣品加300 μL組織裂解液的比例加入裂解液，同時(shí)加入1%核酸酶和1%PIC，混勻、勻漿，研磨時(shí)避免產(chǎn)生泡沫。然后室溫變性作用60 min。4℃ 20 627×g離心30 min，收集上清液，應(yīng)用Bradford法測(cè)定每份蛋白質(zhì)樣品濃度，分裝后－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.蛋白質(zhì)樣品的熒光標(biāo)記:將空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和治療組樣品pH值調(diào)至8.5。避光條件下50 μg空白對(duì)照組樣品(5 ～ 10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 模型對(duì)照組樣品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取兩組樣品 25 μg加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作為內(nèi)標(biāo)1)。另取兩組樣品進(jìn)行反標(biāo)，即空白對(duì)照組樣品中加入CyDye Cy5、模型對(duì)照組樣品中加入CyDye Cy3，樣品和熒光染料用量以及內(nèi)標(biāo)1設(shè)置同上。

避光條件下50 μg模型對(duì)照組樣品(5～10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 治療組樣品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取兩組樣品25 μg 加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作為內(nèi)標(biāo)2)。另取兩組樣品進(jìn)行反標(biāo)，即模型對(duì)照組樣品中加入CyDye Cy5、治療組樣品中加入CyDye Cy3，樣品和熒光染料用量以及內(nèi)標(biāo)2設(shè)置同上。

避光冰浴30 min后，加入10 mmol/L賴氨酸1 μL終止反應(yīng)。

6.差異蛋白質(zhì)篩選:采用熒光差異雙向凝膠電泳法(2D DIGE)。將3種熒光染料標(biāo)記的蛋白混合，重泡漲液定容至450 μL。20℃條件下采用Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀將24 cm IPG膠條水化重泡漲6 h，以設(shè)定程序進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦(IEF)，總電壓時(shí)間為80 000 V·h。然后將膠條分別放置在含2%DTT和4%IAA膠的平衡液中各振蕩平衡15 min，再移至12.5%的SDS－聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)均一膠上，行第二向SDSPAGE電泳。置于Ettan DALTsix大規(guī)模垂直電泳儀中20℃、40 mA恒電流電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端。Typhoon 9410多功能激光掃描成像系統(tǒng)掃描雙向電泳凝膠，Cy2的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為480、530 nm，Cy3分別為540、590 nm，Cy5 分別為620、680 nm。掃描后采用DeCyder 5.0軟件(美國(guó)Amersham Bioscience公司)分析圖像文件，挑選出空白對(duì)照組與模型對(duì)照組、模型對(duì)照組與和治療組之間蛋白表達(dá)量比值絕對(duì)值≥1.4的差異蛋白點(diǎn)。

7.差異蛋白質(zhì)鑒定:采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI－TOF MS)。取空白對(duì)照組和模型對(duì)照組蛋白樣品各500 μg以及模型對(duì)照組和治療組樣品各500 μg，按常規(guī)方法行雙向電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色，采用Ettan Spot Picker全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)機(jī)械手臂挖取與明顯差異表達(dá)蛋白點(diǎn)相匹配的蛋白點(diǎn)。50%乙腈沖洗、胰蛋白酶消化、自動(dòng)質(zhì)譜點(diǎn)樣系統(tǒng)Ettan Spotter行蛋白樣品點(diǎn)樣后，應(yīng)用4800 Plus MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，獲取含有序列信息的二級(jí)質(zhì)譜圖，應(yīng)用MASCOT軟件在國(guó)際蛋白質(zhì)索引(international protein index，IPI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配，獲取應(yīng)用MALDITOF－MS/MS技術(shù)鑒定差異蛋白質(zhì)的得分。當(dāng)某個(gè)蛋白質(zhì)的得分＞60時(shí)，可以認(rèn)為鑒定成功。應(yīng)用Gene Ontology軟件對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行功能和亞細(xì)胞定位分類。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、模型驗(yàn)證

AWR評(píng)分為3分時(shí)，造模大鼠(包括模型對(duì)照組和治療組大鼠)和空白對(duì)照組所需的注水量分別為(0.90±0.12)mL和(1.49±0.18)mL，造模大鼠的內(nèi)臟敏感性明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，表明造模成功。

二、痛瀉要方對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

AWR評(píng)分為3分時(shí)，模型對(duì)照組大鼠所需的直腸注水量明顯低于空白對(duì)照組［(0.90±0.16)mL對(duì)(1.63±0.17)mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示模型對(duì)照組大鼠內(nèi)臟敏感性明顯增高。給予痛瀉要方治療后，治療組注水量明顯高于模型對(duì)照組［(1.23±0.10)mL對(duì)(0.90±0.16)mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示治療組內(nèi)臟敏感性較模型對(duì)照組明顯降低。

三、差異蛋白質(zhì)篩選

經(jīng)DeCyder 6.5軟件分析，治療組和模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜組織樣品中共有1278個(gè)蛋白匹配點(diǎn)，其中差異表達(dá)蛋白點(diǎn)61個(gè)，23個(gè)蛋白點(diǎn)在治療組的表達(dá)明顯上調(diào)，38個(gè)蛋白點(diǎn)在治療組明顯下調(diào)(見圖1)。

四、差異蛋白質(zhì)鑒定

從61個(gè)差異蛋白點(diǎn)中人工篩選出5個(gè)差異表達(dá)明顯的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。經(jīng)IPI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出3個(gè)特異蛋白質(zhì)(見表1)，治療組大鼠結(jié)腸黏膜組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為Transgelin(TAGLN)蛋白和乙醛脫氫酶2(Aldh2)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)為角蛋白8(CK8)。

圖1 治療組和模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜組織蛋白樣品的熒光差異雙向凝膠電泳圖

表1 治療組和模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜組織間差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

討 論

痛瀉要方源自《景岳全書》，具有補(bǔ)脾柔肝、祛濕止瀉之功效，長(zhǎng)期臨床觀察證實(shí)其對(duì)腹痛、腹瀉療效顯著。IBS發(fā)病的病理基礎(chǔ)為肝郁脾虛，病機(jī)主要在于肝脾氣機(jī)不暢，運(yùn)化失常，大腸傳導(dǎo)失司，日久及腎，形成肝、脾、腎、腸胃諸臟功能失調(diào)。憂思惱怒，久郁不解，傷及于肝，肝氣不疏，橫逆及脾，脾氣失和，可形成肝脾不調(diào)證。痛瀉要方所治痛瀉，是由脾虛肝旺、肝氣乘脾、升降失常而致，所謂“土虛木賊”之證，即肝郁脾虛證。痛瀉要方由白術(shù)、陳皮、白芍、防風(fēng)中藥組成，其中白術(shù)燥濕健脾，白芍養(yǎng)血瀉肝，陳皮理氣醒脾，防風(fēng)散肝舒脾。諸藥合用，可補(bǔ)脾土而瀉肝木，調(diào)氣機(jī)以止痛瀉。結(jié)合痛瀉要方對(duì)IBS有疏肝健脾、益氣和胃的功效［6］。

本研究以痛瀉要方治療4周后，治療組大鼠內(nèi)臟敏感性明顯降低(P＜0.01)，說(shuō)明補(bǔ)脾柔肝法對(duì)調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏感具有一定的作用。以藥測(cè)證，由此推測(cè)大鼠內(nèi)臟敏感性的形成機(jī)制主要為肝郁脾虛。任何形式的應(yīng)激首先影響機(jī)體正常氣機(jī)，肝主疏泄可調(diào)節(jié)全身氣機(jī)，因此肝臟可能是機(jī)體調(diào)節(jié)應(yīng)激的核心，肝主疏泄功能對(duì)機(jī)體應(yīng)激具有重要的調(diào)節(jié)作用［7］。IBS腹痛、腹部不適與內(nèi)臟高敏感高度相關(guān)，而IBS腹痛、腹部不適反復(fù)發(fā)作多與心理因素有關(guān)，如著急或生氣時(shí)易發(fā)作，說(shuō)明氣機(jī)郁滯可能是內(nèi)臟敏感性增高的主要原因之一，運(yùn)用痛瀉要方能明顯調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏感大鼠的內(nèi)臟敏感性。

TAGLN是具有轉(zhuǎn)型變異和形狀改變敏感性的肌動(dòng)蛋白凝膠蛋白，由 Lees－Miller等［8］在雞平滑肌中首先發(fā)現(xiàn)。TAGLN蛋白在平滑肌中表達(dá)較高，可能與細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架重排有關(guān)。程云會(huì)等［9］的研究結(jié)果表明，TAGLN基因參與血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞骨架構(gòu)成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮功能，對(duì)維持血管平滑肌細(xì)胞處于收縮表型具有重要作用。Aldh2催化乙醛脫氫生成乙酸，后者進(jìn)入三羧酸循環(huán)，代謝為CO2和H2O，是乙醇代謝的關(guān)鍵酶之一。本研究發(fā)現(xiàn)給予痛瀉要方治療后，TAGLN蛋白和Aldh2表達(dá)均較模型對(duì)照組明顯上調(diào)，但其與內(nèi)臟敏感性的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

上皮細(xì)胞內(nèi)含有20種CK，CK8在維持胃腸道上皮結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用。CK8缺失小鼠可發(fā)生慢性結(jié)腸炎［10］和水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂［11］，為細(xì)菌移位致病創(chuàng)造條件。CK8突變可引起人腸道上皮細(xì)胞抵抗力降低，可能在炎癥性腸病的發(fā)生中扮演重要角色［12］。有文獻(xiàn)報(bào)道IBS患者存在腸道部分菌群失調(diào)以及黏膜低度炎癥［13］。CK8表達(dá)增加可能在腸道黏膜上皮抗促炎刺激物中發(fā)揮作用。本課題組的前期研究［14］顯示內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸黏膜組織中CK8表達(dá)增加，提示結(jié)腸黏膜存在低度炎癥反應(yīng)，可能引起內(nèi)臟敏感性增高。本研究給予痛瀉要方治療后，大鼠結(jié)腸黏膜CK8蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組下調(diào)，內(nèi)臟敏感性亦明顯降低，提示痛瀉要方可下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能是其降低大鼠內(nèi)臟敏感性的機(jī)制之一。但I(xiàn)BS的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括腸道免疫、炎癥、神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控變化等。針對(duì)目前已鑒定出來(lái)的2個(gè)上調(diào)蛋白和1個(gè)下調(diào)蛋白在IBS發(fā)生和治療中的作用，尚需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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