高 欣 張振玉 徐兆軍 姜宗丹 陳菲菲 王勁松

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科1(210006) 病理科2

胃食管反流病(GERD)系指胃內(nèi)容物反流入食管，引起不適癥狀和(或)并發(fā)癥的一種疾病，可分為非糜爛性反流病(NERD)、糜爛性食管炎(EE)和Barrett食管(BE)［1］。肥大細(xì)胞(mast cells，MC)是一種廣泛存在于人體組織，尤其是皮膚、呼吸道和消化道的組織細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)有大量含組胺、類胰蛋白酶(tryptase)、肝素等介質(zhì)的分泌顆粒，MC活化脫顆粒可在組織內(nèi)引起速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)(炎癥)。多項(xiàng)研究［2～6］發(fā)現(xiàn)MC活化脫顆?；蚣?xì)胞溶解釋放的炎癥介質(zhì)參與了酸或膽汁誘導(dǎo)的食管黏膜損傷。蛋白酶激活受體－2(protease－activated receptor－2，PAR－2)廣泛表達(dá)于消化道，可被胰蛋白酶激活，誘導(dǎo)促炎反應(yīng)。對(duì)不同類型GERD患者和無(wú)反流對(duì)照者食管黏膜中 PAR－2 表達(dá)和分布的研究［7，8］顯示，PAR－2活化和表達(dá)上調(diào)在GERD的發(fā)生及其相關(guān)黏膜改變和炎癥反應(yīng)中起重要作用。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)GERD患者食管黏膜上皮中的MC數(shù)量和PAR－2表達(dá)情況并分析其間的相關(guān)性，旨在明確兩者在GERD發(fā)病中的意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入62例于2007年1月～2008年12月因反酸、燒心等反流癥狀在南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院就診，經(jīng)胃鏡檢查、24 h食管pH監(jiān)測(cè)和質(zhì)子泵抑制劑(PPI)試驗(yàn)確診的 GERD 患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)［1，9］:①24 h食管pH監(jiān)測(cè)DeMeester評(píng)分＜14.72為酸反流陰性，≥14.72為酸反流陽(yáng)性(病理性酸反流);②內(nèi)鏡檢查見(jiàn)食管遠(yuǎn)端黏膜破損，排除其他原因后可診斷為EE;③有典型或不典型反流癥狀，內(nèi)鏡檢查未見(jiàn)食管黏膜破損且24 h食管pH監(jiān)測(cè)或PPI試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性可診斷為NERD。同期20例無(wú)反流癥狀、胃鏡檢查無(wú)異常發(fā)現(xiàn)、對(duì)研究方案知情同意的非GERD患者作為正常對(duì)照組。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.標(biāo)本采集:入組受檢者于胃鏡檢查時(shí)在齒狀線上方2～3 cm鱗狀上皮處(EE患者于糜爛周圍相對(duì)正常黏膜處)取一塊活檢組織，4%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，用于免疫組化染色。

2.免疫組化染色:采用EnVision免疫組化二步法(EnVision免疫組化檢測(cè)試劑盒，DAKO公司)。鼠抗人MC類胰蛋白酶單克隆抗體為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品，可直接使用，無(wú)需稀釋;山羊抗PAR－2多克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology，Inc.產(chǎn)品，使用時(shí)按1∶200稀釋。具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

3.MC計(jì)數(shù):類胰蛋白酶陽(yáng)性MC呈棕褐色。于光學(xué)顯微鏡下(×400)選取陽(yáng)性細(xì)胞密度最高的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值。

4.PAR－2免疫組化評(píng)分:PAR－2陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色。于光學(xué)顯微鏡下(×100)選取表達(dá)強(qiáng)度最高的5個(gè)視野，分別行胞質(zhì)著色評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分，PAR－2免疫組化評(píng)分為各視野兩項(xiàng)評(píng)分乘積的均值。胞質(zhì)著色評(píng)分:無(wú)表達(dá)，0分;弱表達(dá)，1分;中等表達(dá)，2分;強(qiáng)表達(dá)，3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，0分;＜10%，1分;≥10%且＜50%，2分;≥50%且＜80%，3分;≥80%，4分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，兩變量間相關(guān)性的分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

62例 GERD患者中男34例，女28例，年齡26～78歲，平均(50.0±13.7)歲。EE組30例，男18例，女12例，年齡29～74歲，平均(49.4±11.5)歲;NERD組32例，男、女各16例，年齡26～78歲，平均(51.1±15.2)歲。20例正常對(duì)照者中男、女各10例，年齡27～75歲，平均(63.8±7.1)歲。三組間性別構(gòu)成和平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、食管黏膜上皮MC數(shù)量

食管黏膜上皮類胰蛋白酶免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于MC胞質(zhì)中，少數(shù)MC胞質(zhì)、胞核均著色。EE組和NERD組MC數(shù)量均明顯多于正常對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EE組與NERD組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1、表1)。

三、食管黏膜上皮PAR－2表達(dá)

食管黏膜上皮PAR－2免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)。EE組和NERD組PAR－2免疫組化評(píng)分均明顯高于正常對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EE組與NERD組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1、表1)。

圖1 MC、PAR-2在各組食管黏膜上皮中的表達(dá)和分布(免疫組化染色，×100)

表1 各組食管黏膜上皮MC數(shù)量和PAR-2免疫組化評(píng)分比較()

表1 各組食管黏膜上皮MC數(shù)量和PAR-2免疫組化評(píng)分比較()

＊與正常對(duì)照組比較，P＜0.01

組 別 例數(shù) MC數(shù)量 PAR－2免疫組化評(píng)分正常對(duì)照組20 2.82±1.01 2.56±1.20 NERD組 32 7.23±1.55* 6.09±1.55*EE組 30 7.36±0.97* 6.15±1.44*

四、GERD患者食管黏膜上皮MC數(shù)量與PAR－2免疫組化評(píng)分的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，EE組和NERD組中的MC數(shù)量均與PAR－2免疫組化評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.875，P ＜0.01;r=0.884，P＜0.01)。

討 論

MC是一種重要的炎性細(xì)胞，廣泛分布于消化道黏膜，組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，MC可被激活，進(jìn)而產(chǎn)生脫顆粒效應(yīng)，釋放大量炎癥介質(zhì)，放大炎癥反應(yīng)。Barclay等［6］予負(fù)鼠食管腔內(nèi)灌注 HCl，發(fā)現(xiàn)其食管黏膜著色MC數(shù)量較對(duì)照組減少約50%，MC平均面積、核面積和完整顆粒面積亦顯著降低，提示食管酸暴露可使黏膜中的MC活化脫顆?；蚴辜?xì)胞溶解釋放炎癥介質(zhì)，從而參與EE的病理生理學(xué)機(jī)制。其后多項(xiàng)研究［2～5］證實(shí)食管黏膜暴露于酸或膽汁可激活MC脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起食管黏膜損傷。類胰蛋白酶是活化的MC釋放的介質(zhì)之一，具有胰蛋白酶樣活性，在MC介導(dǎo)的多種反應(yīng)中起重要作用，常被作為MC活化的標(biāo)記物［10］。本研究以類胰蛋白酶陽(yáng)性細(xì)胞代表MC，發(fā)現(xiàn)EE組和NERD組食管黏膜上皮中的MC數(shù)量顯著多于正常對(duì)照組，證實(shí)了MC在GERD發(fā)病機(jī)制中的作用。

PARs家族迄今已發(fā)現(xiàn)四種亞型，分別為PAR－1、PAR－2、PAR－3、PAR－4，其中 PAR－2 廣泛表達(dá)于內(nèi)皮組織、粒細(xì)胞以及消化道，能被多種絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、類胰蛋白酶激活，在胃腸道炎癥反應(yīng)中起重要作用。Kandulski等［7］發(fā)現(xiàn)GERD患者食管黏膜上皮中的PAR－2基因表達(dá)顯著上調(diào)，上皮層PAR－2彌漫強(qiáng)陽(yáng)性染色，PAR－2表達(dá)上調(diào)與促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－8(IL－8)表達(dá)以及食管黏膜組織形態(tài)學(xué)改變呈正相關(guān);體外實(shí)驗(yàn)亦顯示，培養(yǎng)于酸性培養(yǎng)基中的食管鱗狀上皮細(xì)胞PAR－2基因表達(dá)顯著上調(diào)，PAR－2的活化可引起 IL－8表達(dá)和分泌。這些發(fā)現(xiàn)提示PAR－2介導(dǎo)的通路參與了GERD的發(fā)病機(jī)制。Inci等［8］的研究顯示食管黏膜上皮中的PAR－2可被十二指腸胃食管反流物中的胰蛋白酶激活，胰蛋白酶－PAR－2通路參與了GERD的發(fā)病機(jī)制。本研究同樣觀察到EE組和NERD組食管黏膜上皮中的PAR－2表達(dá)顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組，證實(shí)PAR－2表達(dá)上調(diào)與GERD的發(fā)生密切相關(guān)。

何韶衡等［11，12］發(fā)現(xiàn) PAR－2 激動(dòng)劑可高效激活人結(jié)腸MC，誘導(dǎo)其釋放類胰蛋白酶和組胺，表明MC上可能存在PAR－2，PAR－2為MC表面的重要受體。推測(cè)MC可通過(guò)其分泌的類胰蛋白酶激活自身或鄰近MC的PAR－2，對(duì)脫顆粒信號(hào)進(jìn)行自我放大，從而放大炎癥反應(yīng)。Jacob等［13］的研究證實(shí)，在應(yīng)激和炎癥狀態(tài)下，MC釋放的類胰蛋白酶可激活結(jié)腸細(xì)胞上的PAR－2，從而增加細(xì)胞間隙通透性。目前尚未見(jiàn)關(guān)于MC與PAR－2在GERD中關(guān)系的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)EE和NERD患者食管黏膜上皮中的MC數(shù)量增多、PAR－2表達(dá)上調(diào)且兩者呈正相關(guān)，提示MC在GERD患者食管黏膜損傷中的作用可能與PAR－2的活化有關(guān)，且兩者在EE和NERD中的作用未顯示出明顯差異。

綜合本研究以及既往研究結(jié)果，可以認(rèn)為食管黏膜上皮中的MC與PAR－2共同參與了GERD的發(fā)病機(jī)制。推測(cè)在GERD發(fā)生過(guò)程中，食管黏膜上皮中的PAR－2被廣泛激活，分布于MC表面的PAR－2活化后激活MC，誘導(dǎo)其脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)，同時(shí)反流的酸或膽汁亦可能激活MC，而MC釋放的類胰蛋白酶又可激活PAR－2，MC由此對(duì)脫顆粒信號(hào)進(jìn)行自我放大，從而放大炎癥反應(yīng)，加重食管黏膜損傷。由于本研究采用的是回顧性研究方法，對(duì)入組GERD患者的病史資料掌握有限，缺乏EE內(nèi)鏡分級(jí)資料，且內(nèi)鏡活檢組織均取自肉眼觀察相對(duì)正常的食管黏膜，常規(guī)病理檢查無(wú)特殊發(fā)現(xiàn)，故未能進(jìn)一步分析MC和PAR－2與EE內(nèi)鏡分級(jí)、食管黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn)之間的關(guān)系以及患者接受規(guī)范治療前后兩者的變化。后續(xù)研究擬采用前瞻性研究方法，對(duì)MC和PAR－2在GERD發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行更深入的探索。

1 林三仁，許國(guó)銘，胡品津，等;中國(guó)胃食管反流病共識(shí)意見(jiàn)專家組.中國(guó)胃食管反流病共識(shí)意見(jiàn)(2006年10月三亞)［J］. 胃腸病學(xué)，2007，12(4):233－239.

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