徐 然，李 偉，史恩祥，牛曉東

血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

徐 然，李 偉，史恩祥，牛曉東

目的 探討乳腺癌患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體表達(dá)水平及其臨床意義。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測(cè)70例乳腺癌、35例乳腺良性病變、30例健康體檢者血清MMP-9抗體濃度，同時(shí)采用免疫組化EnVision分別檢測(cè)各組標(biāo)本中MMP-9的表達(dá)水平，以了解兩種檢測(cè)方法的一致性，分析血清MMP-9抗體與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 ELISA檢測(cè)血清MMP-9抗體在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)均明顯高于乳腺良性病變和健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);EnVision檢測(cè)血清MMP-9在健康體檢組、乳腺良性病變組、乳腺癌組中的表達(dá)分別為陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，這兩種檢測(cè)方法結(jié)果呈一致性(P＜0．01)。血清MMP-9的表達(dá)與乳腺癌的年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)無(wú)關(guān)(P＞0．05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)表達(dá)有關(guān)(P＜0．01)。血清MMP-9的表達(dá)與ER、PR呈正相關(guān)(P＜0．01)。結(jié)論 乳腺癌患者血清MMP-9表達(dá)水平明顯升高，因此，檢測(cè)血清MMP-9對(duì)乳腺癌的預(yù)后及病情評(píng)估有重要的價(jià)值。

乳腺腫瘤;基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移造成的器官功能衰竭是乳腺癌患者的常見(jiàn)死因，因此，尋找早期能夠預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的指標(biāo)成為研究的趨勢(shì)。血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切的蛋白水解酶，本研究欲通過(guò)檢測(cè)乳腺癌患者M(jìn)MP-9抗體表達(dá)水平，探討其與雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以便為預(yù)后判斷及病情監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及病例資料 收集2008年6月—2011年5月我院經(jīng)臨床病理醫(yī)生診斷為乳腺癌標(biāo)本70例，年齡22～75歲，平均47歲。術(shù)前均未接受放化療及激素治療。其中腫瘤直徑≤2 cm者9例，＞2 cm者61例;有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無(wú)轉(zhuǎn)移者21例。依據(jù)參考文獻(xiàn)［1］中組織學(xué)類(lèi)型及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為:非特殊型58例，包括乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌41例和乳腺浸潤(rùn)性小葉癌17例;特殊型12例，包括小管癌2例、髓樣癌4例、黏液癌3例和乳頭狀癌3例。組織學(xué)Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)35例，Ⅲ級(jí)20例。PR陽(yáng)性35例，陰性35例;ER陽(yáng)性40例，陰性30例;HER-2陽(yáng)性32例，陰性38例。選擇同期乳腺良性病變組織標(biāo)本35例，年齡18～48歲，平均34歲;健康體檢者30例，年齡24～51歲，平均35歲。所有患者無(wú)妊娠、感染、代謝性疾病、肝腎功能不全和心腦血管疾病等并發(fā)癥。

1.2 方法 取受試對(duì)象清晨空腹靜脈血2．0 ml，靜置后分離出清亮血清，置潔凈試管中，于－70℃低溫保存待測(cè)。分離時(shí)采用3000 r/min，離心15 min。所有標(biāo)本采用深圳晶美生物公司提供的MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒。操作步驟由專業(yè)人員嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用Bio-RAD680酶標(biāo)儀進(jìn)行比色定量分析。MMP-9抗體為即用型鼠抗人單克隆抗體(DN-105)，免疫組化試劑盒及DAB底物顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化EnVision兩步法，步驟參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 血清MMP-9抗體濃度以健康體檢者的數(shù)據(jù)為參考，≥(198．53 ±61．37)ng/ml為陽(yáng)性，＜(198．53 ±61．37)ng/ml為陰性。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［2］:每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，用半定量積分法判定結(jié)果:著色細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;著色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;兩者乘積0分為(－)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，單因素多樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，兩兩間差異比較采用SNK法;計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman分析，檢測(cè)方法一致性分析采用Kappa分析，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血清MMP-9抗體與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 血清MMP-9抗體的表達(dá)與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)及HER-2的表達(dá)無(wú)關(guān)(P＞0．05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及PR的表達(dá)相關(guān)(P ＜0．01)。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 血清MMP-9與ER、PR表達(dá)的關(guān)系 乳腺癌患者血清MMP-9與ER表達(dá)均陽(yáng)性39例，均陰性17例，ER陽(yáng)性而 MMP-9陰性 1例，ER陰性而MMP-9陽(yáng)性13例，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0．61，P ＜0．01);乳腺癌患者血清MMP-9與PR表達(dá)均陽(yáng)性33例，均陰性16例，PR陽(yáng)性而MMP-9陰性2例，PR陰性而MMP-9陽(yáng)性19例，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0．46，P ＜0．01)。

2.3 MMP-9抗體在不同乳腺組織中的表達(dá)ELISA檢測(cè) MMP-9含量乳腺癌組為(386．92±98．86)ng/ml，乳 腺 良 性 病 變 組 為 (258．31 ±73．15)ng/ml，健康體檢組為(198．53 ±61．37)ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13．46，P ＜0．01)。EnVision檢測(cè)MMP-9在健康體檢者中表達(dá)陰性，在乳腺良性病變的表達(dá)弱陽(yáng)性，在乳腺癌的表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。經(jīng)Kappa分析顯示，這兩種方法檢測(cè)結(jié)果呈一致性(κ =0．474，P ＜0．01)。

圖1 血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9在不同乳腺組織中的表達(dá)情況EnVision×100

3 討論

浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特性之一，腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中需要擺脫細(xì)胞－細(xì)胞之間的連接和破壞細(xì)胞外基質(zhì)的防御結(jié)構(gòu)等。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解過(guò)程中重要的蛋白水解酶，參與機(jī)體的許多生理和病理過(guò)程［2］。MMP-9由多種細(xì)胞分泌，包括惡性腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞和其他細(xì)胞［3］。MMP-9在惡性腫瘤中的過(guò)度表達(dá)及在浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用已被證實(shí)［4-6］。MMP-9不僅能降解Ⅳ型膠原及纖維粘連蛋白等基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，而且還對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附能力有影響，在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7-12］。

本研究結(jié)果顯示，血清MMP-9的水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及PR表達(dá)有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，血清MMP-9表達(dá)水平越高;與年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)及HER-2的表達(dá)無(wú)關(guān)。所以，血清MMP-9水平可作為評(píng)估乳腺癌轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。有研究顯示，將腫瘤細(xì)胞移植入MMP-9或MMP-9基因缺失的鼠體內(nèi)，與正常對(duì)照鼠比較，腫瘤血管生成明顯減少。這預(yù)示其在腫瘤血管生成中與血管生成因子有協(xié)同作用［13］。據(jù)此推斷，血清MMP-9水平越高，腫瘤血管生成可能性越大，可考慮抗血管生成治療。本資料結(jié)果顯示，乳腺癌血清MMP-9表達(dá)與ER、PR均呈正相關(guān)。提示三者在乳腺癌病變中存在協(xié)同、促進(jìn)作用，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

本研究顯示，ELISA檢測(cè)血清MMP-9的含量在健康體檢組、乳腺良性病變組及乳腺癌組中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。提示MMP-9的表達(dá)可反映乳腺癌的惡性程度。EnVision檢測(cè)MMP-9在健康體檢組中的表達(dá)陰性，在乳腺良性病變的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，在乳腺癌的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，經(jīng)Kappa分析結(jié)果呈一致性，提示ELISA與EnVision檢測(cè)都能很好地反應(yīng)MMP-9的表達(dá)情況，但ELISA檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、方便、用時(shí)比較短，可及時(shí)反應(yīng)患者情況。

綜上所述，血清MMP-9表達(dá)水平在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件，因而，檢測(cè)血清中MMP-9表達(dá)能指導(dǎo)臨床藥物治療方案的選擇，并預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況。

［1］程虹，戴林，郭雙平，等．乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:2-13．

［2］楊俊川，劉金彪，王新征，等．KAI1/CD82、MMP-2在乳腺癌中的表達(dá)及意義［J］．河南科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，28(1):12-14．

［3］倪培華，應(yīng)雅韻，張潔，等．肝脂酶啟動(dòng)子250G/A多態(tài)性與血脂的關(guān)系［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005，20(6):565-570．

［4］陳力，林爾將，李強(qiáng)，等．基質(zhì)金屬蛋白酶-9在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義［J］．浙江實(shí)用醫(yī)學(xué)，2009，14(6):441-443．

［5］陶識(shí)博，張蕾，張?jiān)茲h，等．食管鱗癌中 MTA1、MMP-9和MVD的表達(dá)及其臨床病理意義［J］．河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，29(1):29-33．

［6］趙重怡．基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與子宮內(nèi)膜異位癥的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1(1):68-69，87．

［7］楊少奇，李西梅，何芳，等．OPN、MMP-9在胰腺癌及其侵襲轉(zhuǎn)移中的表達(dá)［J］．寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2009，31(12):1092-1094．

［8］Pryczynicz A，Guzinska Ustymowicz K，Dymicka Piekarska V，et al．Expression of matrix metalloproteinase 9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation［J］．Folia Histochem Cytobiol，2007，45(1):37-40．

［9］孟茜．MMP-9和survivin在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48(8):1-2，15．

［10］張杰，許俊龍，張學(xué)東，等．甲狀腺乳頭狀癌 VEGF、MMP-9及COX-2蛋白表達(dá)與淋巴道轉(zhuǎn)移和血管生成的相關(guān)性［J］．腫瘤防治研究，2010，37(4):441-444．

［11］李慧榮，齊鴻亮．CD44v6和MMP-9在腺樣囊性癌中的表達(dá)及臨床意義［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(1):21-23．

［12］孫曉杰，王淑英，李珅，等．PI3Kp55γ調(diào)節(jié)亞基N末端對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響［J］．中華腫瘤防治雜志，2009，16(12):881-884．

［13］姚強(qiáng)．基質(zhì)金屬蛋白酶及其與惡性腫瘤的關(guān)系［J］．中外醫(yī)療，2010，29(6):181．

Expression and Clinical Significance of Serum Matrix Metalloproteinases-9(MMP-9)in Breast Cancer

XU Rana，LI Weib，SHI En-xianga，NIU Xiao-dongb(The 251stHospital of PLA a．Department of Blood Bank;b．Department of Pathology，Zhangjiakou，Hebei 075000，China)

Objective To explore the expressions and clinical significance of MMP-9 antibody in blood serum in treating patients with breast cancer．Methods Eenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was taken to detect MMP-9 antibody concentration in breast cancer(70 cases)，benign breast diseases(35 cases)and healthy women(30 cases)．At the same time MMP-9 was tested by EnVision for every group to study the consistency between ELISA and EnVision，and to analyze the relationships between MMP-9 antibody and the clinical pathological factors of breast cancer．Results The expression of serum MMP-9 antibody tested by ELISA in breast cancer was significantly higher than that in benign breast diseases and healthy women(P ＜0．01);The expressions of MMP-9 tested by EnVision in healthy women group，benign breast diseases group and breast cancer group were negative，weakly positive and strongly positive respectively;The result of the two defferent test methods was consistent(P ＜0．01)．The expression of serum MMP-9 antibody had no statistical difference in age，tumor size，histological category，histological grade and HER-2(P ＞0．05)，but was related to lymphatic metastasize，the expression of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)(P ＜0．01)．There was direct correlation between the expression of serum MMP-9 and ER，PR(P ＜0．01)．Conclusion The blood serum levels of MMP-9 antibody in breast cancer increase remarkably，so the detection of serum levels of MMP-9 is of great value in evaluations of prognosis and pathogenetic condition．

Breast neoplasms;Matrix metalloproteinases;Enzyme-Linked immunosorbent assay

R737．9

A

2095-140X(2012)08-0015-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2012．08．004

2012-04-20 修回時(shí)間:2012-05-17)

075000河北張家口，解放軍251醫(yī)院輸血科(徐然、史恩祥)，病理科(李偉、牛曉東)

李偉，電話:18932738821;E-mail:liwei-324@163．com