胡 杰，王 琳，隗慧林，王書崎，徐 峰

肺結(jié)核即時(shí)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

胡 杰，王 琳，隗慧林，王書崎，徐 峰

肺結(jié)核給全球特別是發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)的公共衛(wèi)生健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。潛伏期、耐藥性肺結(jié)核的檢測(cè)，以及患者依從性差給全球肺結(jié)核的預(yù)防和控制提出了新的難題。WHO要求對(duì)結(jié)核病檢測(cè)成本低廉、使用方便、快速可靠、無(wú)需設(shè)備，且普及性強(qiáng)。因此，本文總結(jié)了現(xiàn)有的基于免疫血清學(xué)和分子生物學(xué)開(kāi)發(fā)的肺結(jié)核診斷產(chǎn)品，以及即時(shí)診斷(point-of-care testing，POCT)技術(shù)的最新研究進(jìn)展，以期為將來(lái)開(kāi)發(fā)新型高效的結(jié)核病POCT技術(shù)和產(chǎn)品提供思路。

結(jié)核，肺;診斷技術(shù)和方法;研究技術(shù)

肺結(jié)核(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)引起的一種傳染性疾病。它是影響全球人類健康的主要傳染性疾病之一［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報(bào)告顯示，2010年全球約有1200萬(wàn)肺結(jié)核患者，新增患者880萬(wàn)，死亡人數(shù)達(dá)145萬(wàn)［2］。其中超過(guò)50%的新增患者分布在亞洲(59%)，而中國(guó)(12%)僅次于印度(26%)，位居世界第二［2］。我國(guó)不僅是全球22個(gè)肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐藥肺結(jié)核流行嚴(yán)重的國(guó)家之一［2］。雖然肺結(jié)核可以治愈，且治療成功率相當(dāng)高，但由于目前很多國(guó)家存在著數(shù)目龐大而未確診的病例［3］，對(duì)肺結(jié)核的防控造成一定難度。因此，提高肺結(jié)核的診斷技術(shù)對(duì)已感染的個(gè)體和控制肺結(jié)核在人群中的傳播都是十分必要的。

1 概述

目前，全球控制肺結(jié)核的重點(diǎn)是尋求更早、更有效的檢測(cè)方法，并且擴(kuò)大耐藥性肺結(jié)核的診斷能力［2］。傳統(tǒng)肺結(jié)核的檢測(cè)手段為痰液涂片法，其檢測(cè)靈敏度低，并且取決于患者依從性，因此檢出率不高［1，3］;金標(biāo)準(zhǔn)為痰液培養(yǎng)法，雖然靈敏度高，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，并且檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)［1，3］;有些國(guó)家應(yīng)用胸部X線診斷肺結(jié)核，該方法依賴于大型儀器，且特異性不夠，因而難以推廣和普及［3］。此外，肺結(jié)核檢測(cè)還缺乏有效的生物標(biāo)志物。雖然目前針對(duì)肺結(jié)核不同時(shí)期(潛伏期和活動(dòng)期)及其耐藥性均有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)志物，但它們的特異性和靈敏度不一，無(wú)法用來(lái)作為確診的標(biāo)志物［1，3］。傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足及其可靠的標(biāo)志物的缺失都造成了目前肺結(jié)核在全球范圍持續(xù)傳播的局面。因此，亟需發(fā)現(xiàn)一種可確診肺結(jié)核的有效標(biāo)志物，并發(fā)展一種高效、簡(jiǎn)便、快捷、易推廣的診斷技術(shù)［3-4］。

近年來(lái)，迅速發(fā)展的即時(shí)診斷(point-of-care testing，POCT)成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)新領(lǐng)域，并作為一種新檢驗(yàn)手段［4］。POCT分析方法快速簡(jiǎn)單，可現(xiàn)場(chǎng)分析，減少了樣品轉(zhuǎn)送流程，具有快速、高通量、自動(dòng)化、微型化、高靈敏度以及多參數(shù)同步分析等優(yōu)點(diǎn)［5-6］，將在今后肺結(jié)核診斷檢測(cè)領(lǐng)域占據(jù)重要的地位［4］。同時(shí)，POCT檢測(cè)內(nèi)容也逐步向各個(gè)領(lǐng)域擴(kuò)展(如生化、免疫、微生物、核酸等)，故在傳染性疾病臨床檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的發(fā)展前景。因此，本文總結(jié)了現(xiàn)有的基于免疫血清學(xué)和分子生物學(xué)開(kāi)發(fā)的肺結(jié)核診斷產(chǎn)品，以及POCT技術(shù)的最新研究進(jìn)展，以期為將來(lái)開(kāi)發(fā)新型高效的肺結(jié)核POCT技術(shù)和產(chǎn)品提供思路。

2 POCT技術(shù)產(chǎn)品

2.1 基于血清學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品 目前，肺結(jié)核的血清學(xué)檢測(cè)盡管未被國(guó)際指導(dǎo)方針推薦，但已經(jīng)使用多年［7］，并且基于酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析色譜法開(kāi)發(fā)出多種成熟的市場(chǎng)化產(chǎn)品［7］。但是，Steingart等［8-9］對(duì)68種肺內(nèi)和21種肺外肺結(jié)核血清檢測(cè)產(chǎn)品的性能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)它們的靈敏度和特異性不一致。WHO聯(lián)合多家單位對(duì)19種肺結(jié)核肺內(nèi)快速檢測(cè)產(chǎn)品也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估，結(jié)果表明其靈敏度低，特異性也不一致［10］，因而難以推廣和普及。此外，γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)作為肺結(jié)核臨床常規(guī)檢測(cè)方法之一，在肺結(jié)核發(fā)生率低的歐美國(guó)家，已成為肺結(jié)核尤其是潛伏期肺結(jié)核和肺外結(jié)核的輔助診斷手段。然而其對(duì)活動(dòng)期肺結(jié)核特異性較差，因此對(duì)于潛伏期肺結(jié)核較為流行的中低收入國(guó)家，WHO不建議使用［11］。市場(chǎng)上部分肺結(jié)核快速血清學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品［12-13］的性能比較見(jiàn)表1。

蛋白芯片技術(shù)作為一種高通量、高靈敏度、高特異性且微型化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)［14］，目前也被應(yīng)用于肺結(jié)核蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。現(xiàn)在市場(chǎng)上的結(jié)核蛋白芯片的特點(diǎn)是可對(duì)多種結(jié)核分枝桿菌抗原或抗體進(jìn)行同時(shí)篩查，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確而又有較高的特異性與敏感性，以及檢測(cè)成本低，該技術(shù)為臨床診斷肺結(jié)核起到了積極的作用，在臨床已得到廣泛應(yīng)用。對(duì)于痰涂片檢查陰性、無(wú)痰、肺外結(jié)核病患者的檢出更具優(yōu)越性［15］，但其對(duì)耐藥性肺結(jié)核的高效、特異性檢測(cè)仍存在一定的不足。

表1 部分肺結(jié)核快速血清學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品的性能比較

2.2 基于分子生物學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品 基于分子生物學(xué)技術(shù)的診斷方法越來(lái)越多的應(yīng)用到日常的檢測(cè)工作中，自核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(nucleic acid amplification tests，NAAT)應(yīng)用到肺結(jié)核的早期診斷以來(lái)，就顯示出其強(qiáng)大的優(yōu)越性。因此，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦將NAAT用于診斷活動(dòng)期肺結(jié)核，并建議在第一次取痰時(shí)就應(yīng)行涂片及NAAT檢測(cè)。此外，核酸探針技術(shù)(DNA probe)、DNA指紋技術(shù)等因具備檢測(cè)敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，在肺結(jié)核的診斷中也較常用。

雖然NAAT技術(shù)較涂片法在精確度方面有了巨大的進(jìn)步，較分枝桿菌培養(yǎng)法節(jié)省時(shí)間，但較高的投資及設(shè)備需求極大地限制了其在臨床的應(yīng)用。2010年美國(guó)Cepheid公司開(kāi)發(fā)的GeneXpert MTB/RIF試劑盒可在2 h內(nèi)直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測(cè)是否含有結(jié)核分枝桿菌及對(duì)利福平的耐藥性，整個(gè)過(guò)程都在一密閉環(huán)境中進(jìn)行，手動(dòng)時(shí)間短(≤5 min)，對(duì)操作者和周圍環(huán)境安全［16］(圖1)。但此方法仍需專門的GeneXpert儀器、健全的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施和訓(xùn)練有素的實(shí)驗(yàn)人員的支持，因其高成本和復(fù)雜性限制了該方法在發(fā)展中國(guó)家的廣泛使用［17］。

此外，市場(chǎng)上出現(xiàn)的基因芯片具有檢測(cè)效率高、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)靶分子種類多、結(jié)果可靠性高等優(yōu)勢(shì)，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用［18］。在肺結(jié)核檢測(cè)中主要用于分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)等方面。黃明翔等［19］以BACTECMGIT 960收集了分離到的肺結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物，以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為對(duì)照，應(yīng)用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果表明，DNA芯片檢測(cè)技術(shù)可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異地鑒定大多數(shù)分枝桿菌菌種。但該方法仍然存在著許多難以解決的問(wèn)題，如技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴、檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、分析范圍較狹窄等，有待于進(jìn)一步改進(jìn)和完善。

圖1 GeneXpert MTB/RIF試劑盒操作過(guò)程

總之，市場(chǎng)上現(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)產(chǎn)品還難以滿足肺結(jié)核防控的需求，它們或靈敏度較低，或特異性不強(qiáng)，抑或只能滿足部分患者，無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用。因此，世界范圍內(nèi)的組織、機(jī)構(gòu)以及學(xué)者仍不斷加入到對(duì)肺結(jié)核診斷技術(shù)的研究中，并為診斷技術(shù)的發(fā)展作出了貢獻(xiàn)。

3 POCT診斷技術(shù)研究

從2007年開(kāi)始，WHO推薦使用了一系列肺結(jié)核診斷技術(shù)［4］。到目前為止，雖然尚無(wú)批準(zhǔn)的肺結(jié)核即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)品，但人們對(duì)其特性要求已經(jīng)有所討論［3］。新的肺結(jié)核診斷技術(shù)需具備以下特點(diǎn):實(shí)惠(affordable)、靈敏(sensitive)、特異(specific)、友好(user-friendly)、快速而可靠(rapid and robust)、不依賴儀器(equipment-free)、易于配送(deliverable)［5］。本文將對(duì)在肺結(jié)核診斷技術(shù)發(fā)展中具有良好產(chǎn)業(yè)化前景的基于微流體技術(shù)的試紙檢測(cè)、芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行詳細(xì)介紹，并對(duì)新興的手機(jī)醫(yī)學(xué)在快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用進(jìn)行探討。

3.1 試紙檢測(cè)技術(shù) 試紙檢測(cè)技術(shù)起源于20世紀(jì)50年代，早孕試紙獲得巨大成功后，其思路被大家迅速采納和運(yùn)用。一個(gè)典型的試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、支持墊以及外殼組成。一般檢測(cè)時(shí)，取少量樣品(如唾液、尿液、血液)滴于樣品墊上，定性分析可簡(jiǎn)單地通過(guò)觀察測(cè)試區(qū)的顏色變化而獲得［20］，在15 min內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果。市場(chǎng)商品化的基于抗體－抗原反應(yīng)的肺結(jié)核脂阿拉伯甘露糖(LAM)試紙條見(jiàn)圖2。試紙不僅可以基于抗體－抗原反應(yīng)檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)記物，還可以基于堿基對(duì)之間的雜交互補(bǔ)配對(duì)，檢測(cè)特定的目的DNA或RNA片段(圖3)。試紙條除了定性檢測(cè)外，還可以實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)［21］。Dineva等［22］在試紙條上同時(shí)實(shí)現(xiàn)了乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病病毒(HIV)核酸擴(kuò)增的檢測(cè)。除此之外，Martinez等［23］將微流體技術(shù)引入試紙中，賦予了試紙檢測(cè)新的功能和用途，必將在包括肺結(jié)核在內(nèi)的傳染性疾病檢測(cè)中發(fā)揮作用。

因此，基于新技術(shù)的引入，研究者嘗試開(kāi)發(fā)新型的肺結(jié)核核酸檢測(cè)試紙:①基于傳統(tǒng)定性檢測(cè)試紙的基礎(chǔ)上力求實(shí)現(xiàn)半定量甚至定量檢測(cè);②研發(fā)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)記物的肺結(jié)核檢測(cè)試紙，除了提高其檢測(cè)特異性外，還可應(yīng)用于耐藥性肺結(jié)核的篩查;③為了提高試紙檢測(cè)靈敏度，還可以利用納米技術(shù)進(jìn)行信號(hào)放大。

圖2 蛋白檢測(cè)試紙條

圖3 核酸檢測(cè)試紙條

3.2 芯片檢測(cè)技術(shù) 新興的芯片檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為肺結(jié)核診斷的重要輔助手段。該技術(shù)由于具有檢測(cè)指標(biāo)集成度高、需樣量少、省時(shí)等優(yōu)勢(shì)而迅速發(fā)展。目前，伴隨著微納制造技術(shù)的進(jìn)步，推動(dòng)著芯片檢測(cè)技術(shù)向更新、更寬廣的領(lǐng)域發(fā)展。它可以整合樣品處理到樣品檢測(cè)等多個(gè)單元于一體，因而十分適用現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

Lee等［24］報(bào)道了一種基于芯片的核磁共振系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)多重定量快速檢測(cè)。同時(shí)，利用磁性顆粒作為近距離傳感器，能放大分子間的相互作用，從而能檢測(cè)未經(jīng)處理的生物樣品(圖4)。結(jié)果表明，該檢測(cè)系統(tǒng)可實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌，鑒別部分細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)一系列蛋白質(zhì)標(biāo)記物。隨后，他們將其改造，用于卡介苗的檢測(cè)中，在30 min中內(nèi)痰液檢測(cè)靈敏度為20 cfu/ml［25］。Fang 等［26］開(kāi)發(fā)了一個(gè)整合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)的手持式微芯片。該芯片實(shí)現(xiàn)了DNA快速釋放，信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增，可肉眼讀取單個(gè)或多重檢測(cè)結(jié)果。研究人員將其用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)中，檢測(cè)限為 270 拷貝/μl。Kim 等［27］則開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于免疫熒光的微頭傳感器，可在25 min內(nèi)檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌。該裝置通過(guò)在微頭上修飾特異性的抗體保證其特異性，而通過(guò)耦聯(lián)流體循環(huán)和電場(chǎng)在微頭表明聚集目標(biāo)細(xì)菌以保證其靈敏度，最后通過(guò)免疫熒光檢測(cè)捕獲的細(xì)胞，其檢測(cè)靈敏度為200 cfu/ml。LAMP手持式微芯片和免疫熒光微頭傳感器檢測(cè)結(jié)果均與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。

目前，對(duì)于新型肺結(jié)核POCT核酸檢測(cè)產(chǎn)品的研發(fā)，主要包括兩個(gè)技術(shù)要點(diǎn)，一個(gè)是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)核酸擴(kuò)增，另一個(gè)是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的快速檢測(cè)。對(duì)于核酸擴(kuò)增，除了PCR法，目前已開(kāi)發(fā)出多種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，為基于芯片的核酸擴(kuò)增提供了便利，將其和試紙檢測(cè)相結(jié)合，即可迅速獲得檢測(cè)結(jié)果。因此，利用日益成熟的微納制造技術(shù)，可以將傳統(tǒng)的大型儀器、精密儀器等所具備的功能移植于芯片甚至其一個(gè)小小的單元上，這樣有望一步實(shí)現(xiàn)從樣品到結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)周期和成本。

3.3 手機(jī)醫(yī)學(xué) 隨著新技術(shù)的發(fā)展，手機(jī)不僅用于通信聯(lián)絡(luò)和社交網(wǎng)絡(luò)，在健康保健、環(huán)境檢測(cè)和遠(yuǎn)程醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也很廣泛。手機(jī)在電信系統(tǒng)中處于核心地位，又兼有成像功能，鑒于其應(yīng)用的廣泛性，近年來(lái)手機(jī)在發(fā)展中國(guó)家和資源有限地區(qū)的醫(yī)學(xué)診斷、影像學(xué)檢查領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值備受關(guān)注。手機(jī)的拍照功能可以獲得明場(chǎng)圖片，而利用LED燈進(jìn)行激發(fā)，也可以獲得熒光圖片，從而進(jìn)行檢測(cè)和分析［28］。此外，它還可以和顯微鏡、超聲探頭，以及微流體裝置聯(lián)用。而其自身還可以集成各種功能的軟件，對(duì)采集的數(shù)據(jù)或圖片進(jìn)行處理。通過(guò)手機(jī)終端還能將數(shù)據(jù)發(fā)給醫(yī)療中心，由醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行分析和處理，并將診斷結(jié)果反饋給用戶。

Breslauer等［29］利用標(biāo)準(zhǔn)的、便宜的顯微鏡目鏡和物鏡(放大倍數(shù)和分辨率可由不同的物鏡進(jìn)行調(diào)節(jié))開(kāi)發(fā)出了手機(jī)－光學(xué)顯微鏡(圖5)。他們?cè)诿鲌?chǎng)下對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)感染和鐮刀形紅細(xì)胞，并在LED激發(fā)的熒光下對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的痰標(biāo)本進(jìn)行成像。其上述所有情形的分辨率都超過(guò)了檢測(cè)血細(xì)胞和微生物形態(tài)所需;對(duì)結(jié)核分枝桿菌樣本，他們進(jìn)一步利用數(shù)字相片，通過(guò)影像分析軟件實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)細(xì)菌計(jì)數(shù)。Lee等［25］將其核磁共振芯片進(jìn)一步改造，一方面通過(guò)增加一個(gè)自動(dòng)化的負(fù)反饋系統(tǒng)跟蹤并補(bǔ)償溫度漂移，提高了其在現(xiàn)實(shí)環(huán)境測(cè)量時(shí)的穩(wěn)定性和可靠性，另一方面通過(guò)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)和手機(jī)共享數(shù)據(jù)，從而方便了系統(tǒng)控制［30］。

圖5 手機(jī)－光學(xué)顯微鏡檢測(cè)

目前，麻省理工學(xué)院(MIT)國(guó)際健康創(chuàng)新項(xiàng)目(innovations in international health，IIH)致力于將診斷試紙和手機(jī)通信相結(jié)合，以提高貧窮國(guó)家和地區(qū)的肺結(jié)核治療。該項(xiàng)目組和合作者一起開(kāi)發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的診斷試紙，它能夠檢測(cè)尿液中抗結(jié)核藥物的代謝產(chǎn)物。當(dāng)試紙和患者尿液接觸后，代謝物和試紙上化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，反應(yīng)揭示了一個(gè)密碼，患者將其信息發(fā)給中心數(shù)據(jù)庫(kù)，連續(xù)用藥30 d的患者會(huì)獲得手機(jī)話費(fèi)的獎(jiǎng)勵(lì)。此方法在尼加拉瓜實(shí)地試驗(yàn)已經(jīng)獲得成功，并將在巴基斯坦開(kāi)展更大規(guī)模的試驗(yàn)［31］。

因此，我們一方面可以利用手機(jī)進(jìn)行肺結(jié)核檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和完善，另一方面還可以利用其通訊網(wǎng)絡(luò)，建立遠(yuǎn)程醫(yī)療監(jiān)控，使手機(jī)在肺結(jié)核的診斷、治療及患者依從性方面發(fā)揮作用。

4 前景展望

目前，我國(guó)肺結(jié)核疫情形勢(shì)依然嚴(yán)峻，防控工作仍面臨諸多挑戰(zhàn)。提高我國(guó)肺結(jié)核的診斷能力，發(fā)展比常規(guī)方法快速、即時(shí)、準(zhǔn)確且成本更低的診斷方法控制活動(dòng)期肺結(jié)核是一種必然趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)控制肺結(jié)核流行有重要意義。POCT是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物，是醫(yī)學(xué)進(jìn)步和科學(xué)技術(shù)發(fā)展推動(dòng)產(chǎn)生的儀器小型化和操作程序簡(jiǎn)便化的結(jié)晶，是當(dāng)代科技信息化的反映［32］。診斷裝置小型化，操作簡(jiǎn)單化，結(jié)果報(bào)告即時(shí)化的POCT檢驗(yàn)?zāi)Ｊ绞艿饺藗兊那嗖A。目前，POCT雖集合了多個(gè)學(xué)科的新技術(shù)得到了快速的發(fā)展，但臨床應(yīng)用仍受到限制和制約。因此，POCT是否能夠提供高質(zhì)量、可信賴的檢驗(yàn)結(jié)果則顯得至關(guān)重要。此外，分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展為疾病的診斷和治療提供了廣闊的應(yīng)用前景。伴隨結(jié)核分枝桿菌全部基因組測(cè)序工作的完成，醫(yī)學(xué)診斷進(jìn)入分子基因時(shí)代，基因研究也將進(jìn)入后基因時(shí)代。

目前新的肺結(jié)核診斷技術(shù)是在現(xiàn)有檢測(cè)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)、拓寬，尋找特異性、敏感性高的生物標(biāo)記物結(jié)合其他學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，將多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而提高檢出率。因此，我們希望充分利用結(jié)核分枝桿菌基因組豐富的信息，運(yùn)用一切分子生物學(xué)技術(shù)、微流控技術(shù)和其他技術(shù)手段，發(fā)展一種對(duì)結(jié)核桿菌(尤其是多藥耐藥性結(jié)核桿菌)進(jìn)行快速、高敏核酸檢測(cè)的POCT技術(shù)，開(kāi)發(fā)一種價(jià)格低廉、便攜、高靈敏度、高特異性的肺結(jié)核核酸診斷試劑盒。該類產(chǎn)品不僅可有效地診斷潛在的和結(jié)核桿菌檢測(cè)陰性的肺結(jié)核，而且可對(duì)結(jié)核病耐藥基因進(jìn)行篩查等，為臨床提供較傳統(tǒng)方法更為快速靈敏的檢測(cè)指標(biāo)，該類POCT產(chǎn)品將在未來(lái)的臨床檢驗(yàn)中占有極為重要的地位。

［1］Walzl G，Ronacher K，Hanekom W．Immunological biomarkers of tuberculosis［J］．Nat Rev Immunol，2011，11(5):343-354．

［2］World Health Organization．Global tuberculosis control:WHO report 2011［EB/OL］．［2012-06-20］．http://www．who．int/tb/publications/global_report/en/．

［3］McNerney R，Daley P．Towards a point-of-care test for active tuberculosis:obstacles and opportunities［J］．Nat Rev Microbiol，2011，9(3):204-213．

［4］Wallis R S，Pai M，Menzies D．Biomarkers and diagnostics for tuberculosis:progress，needs，and translation intopractice［J］．Lancet，2010，375(9729):1920-1937．

［5］Lee W G，Kim Y G，Chung B G．Nano/Microfluidics for diagnosis of infectious diseases in developing countries［J］．Adv Drug Deliv Rev，2010，62(4-5):449-457．

［6］Wang S，Xu F，Demirci U．Advances in developing HIV-1 viral load assays for resource-limited settings［J］．Biotechnol Adv，2010，28(6):770-781．

［7］Pinto L M，Grenier J，Schumacher S G．Immunodiagnosis of tuberculosis:state of the art［J］．Med Princ Pract，2012，21(1):4-13．

［8］Steingart K R，F(xiàn)lores L L，Dendukuri N．Commercial serological tests for the diagnosis of active pulmonary and extrapulmonary tuberculosis:an updated systematic review and meta-analysis［J］．PLoS Med，2011，8(8):e1001062．

［9］Steingart K R，Henry M，Laal S，et al．A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis［J］．Thorax，2007，62(10):911-918．

［10］World Health Organization/TDR．Laboratory-based evaluation of 19 commercially-available rapid diagnos-tic tests for tuberculosis［EB/OL］．［2012-06-21］．http://www．who．int/tdr/publications/documents/diagnostic-evaluation-2．pdf．

［11］Denkinger C M，Dheda K，Pai M．Guidelines on interferon-gamma release assays for tuberculosis infection:concordance，discordance or confusion?［J］．Clin Microbiol Infect，2011，17(6):806-814．

［12］賈震，王曉燕．當(dāng)前常用結(jié)核抗體快速檢測(cè)試劑盒臨床使用的對(duì)比觀察［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2004，19(3):180-184．

［13］費(fèi)曉峰，吳建鴻，方明娟．ICT結(jié)核快速免疫色譜卡對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值探討［J］．中國(guó)防癆雜志，2000，22(4):58-59．

［14］Hillemann D，Galle J，Vollmer E．Real-time PCR assay for improved detection of mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-embedded tissues［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2006，10(3):340-342．

［15］沈云華．蛋白芯片技術(shù)快速診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用［J］．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15(34):87-88．

［16］Boehme C C，Nabeta P，Hillemann D．Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance［J］．N Engl J Med，2010，363(11):1005-1015．

［17］He F，Zhao J，Zhang L，Su X．A rapid method for determining mycobacterium tuberculosis based on a bulk acoustic wave impedance biosensor［J］．Talanta，2003，59(5):935-941．

［18］劉愛(ài)英，孫建方，尹躍平，等．基因芯片技術(shù)檢測(cè)生殖器潰瘍性性病病原體［J］．中華皮膚科雜志，2004，37(5):19-21．

［19］黃明翔，王琳，張麗水，等．DNA芯片鑒定分枝桿菌的研究［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(6):555-557．

［20］Mao X，Ma Y，Zhang A，et al．Disposable nucleic acid biosensors based on gold nanoparticle probes and lateral flow strip［J］．Anal Chem，2009，81(4):1660-1668．

［21］隗慧林，蔣法興，徐峰，等．免疫層析法在性傳播感染即時(shí)診斷中的應(yīng)用［J］．解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24(4):1-4．

［22］Dineva M A，Candotti D，F(xiàn)letcher Brown F，et al．Simultaneous visual detection of multiple viral amplicons by dipstick assay［J］．J Clin Microbiol，2005，43(8):4015-4021．

［23］Martinez A W，Phillips S T，Whitesides G M．Diagnostics for the developing world:microfluidic paper-based an alytical devices［J］．Anal Chem，2010，82(1):3-10．

［24］Lee H，Sun E，Ham D，et al．Chip-NMR biosensor for detection and molecular analysis of cells［J］．Nat Med，2008，14(8):869-874．

［25］Lee H，Yoon T J，Weissleder R．Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system［J］．Angew Chem Int Ed Engl，2009，48(31):5657-5660．

［26］Fang X，Chen H，Xu L，et al．A portable and integrated nucleic acid amplification microfluidic chip for identifying bacteria［J］．Lab Chip，2012，12(8):1495-1499．

［27］Kim J H，Yeo W H，Shu Z，et al．Immunosensor towards low-cost，rapid diagnosis of tuberculosis［J］．Lab Chip，2012，12(8):1437-1440．

［28］Wang S，Zhao X，Khimji I．Integration of cell phone imaging with microchip ELISA to detect ovarian cancer HE4 biomarker in urine at the point-of-care［J］．Lab Chip，2011，11(20):3411-3418．

［29］Breslauer D N，Maamari R N，Switz N A．Mobile phone based clinical microscopy for global health applications［J］．PLoS One，2009，4(7):e6320．

［30］Issadore D，Min C，Liong M．Miniature magnetic resonance system for point-of-care diagnostics［J］．Lab Chip，2011，11(13):2282-2287．

［31］Singer E．Take TB Meds，Get Mobile Minutes［EB/OL］．［2012-06-26］．http://www．techn ologyreview．com/news/411618/take-tb-meds-get-mobile-minutes/．

［32］黃祥芬．即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)發(fā)展現(xiàn)狀與應(yīng)用［J］．中外醫(yī)學(xué)研究，2011(25):154-156．

Progression in Point-of-Care Testing for Tuberculosis

HU Jie1，WANG Lin1，WEI Hui-lin2，WANG Shu-qi3，XU Feng1(1．School of Life Science and Technology，the Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，Biomedical Engineering and Biomechanics Center，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China;2．Lauren Biotechnology Ltd，Nanjing 210019，China;3．Brigham and Women's Hospital，Harvard Medical School，Cambridge 02139，U．S．A)

Tuberculosis(TB)has caused a significant medical threat to global health，especially in the developing countries．Latent infection，the spread of drug resistance TB strains and poor patient adherence exacerbate the prevention and control of TB around the world．To promote the use of rapid test for detection of infectious diseases，the World Health Organization(WHO)has released a set of guidelines for developing appropriate diagnostic tools，which are affordable，sensitive，specific，user-friendly，rapid and robust，equipment-free，and deliverable．Nevertheless，there is a lack of such diagnostic tools for TB diagnosis．Thus，we here review current research and development of point-of-care testing(POCT)for TB diagnostics to guide further development of TB rapid tests．

Tuberculosis，pulmonary;Diagnostic techniques and procedures;Investigative techniques

R521;R446-39

A

2095-140X(2012)08-0004-06

10．3969/j．issn．2095-140X．2012．08．002

2012-06-27)

國(guó)家杰出青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10825210);國(guó)家重大國(guó)際(地區(qū))合作研究項(xiàng)目(11120101002);國(guó)家自然科學(xué)基金海外青年學(xué)者合作研究基金(31050110125);高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃項(xiàng)目(111計(jì)劃，B06024);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助

710049西安，西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程和生物力學(xué)中心(胡杰、王琳、徐峰);210019南京，羅潤(rùn)生物科技有限公司(隗慧林);02139 Cambridge，Brigham and Women's Hospital，Harvard Medical School．U．S．A(王書崎)

徐峰，E-mail:fengxu@mail．xjtu．edu．cn;王書崎，E-mail:shuqi．wang@cantab．net