王淑紅 張雄 張勁娥 黃遠亮，3

（1.同濟大學 口腔醫(yī)學院，上海 200072；2.杭州市第一人民醫(yī)院 口腔科，杭州 310006；3.同濟大學附屬東方醫(yī)院 口腔科，上海 200120）

與既往的組織移植、替代材料相比，組織工程技術為骨缺損提供了更理想的修復方法[1-2]，主要包括種子細胞和支架材料兩部分。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨組織工程中較公認的種子細胞，目前的研究主要集中于其成骨潛能[2-3]；支架材料的研究則主要集中在多孔磷酸鈣（calcium phosphate cement，CPC）、磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等無機多孔材料及聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]、明膠海綿（gelatin sponge，GS）等高分子可降解材料領域[3-4]。每種材料各有優(yōu)缺點，其中無機材料因為其良好的生物相容性而得到更多認可，但存在強度不足、降解速率過慢等缺陷，而多數(shù)高分子材料在降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物引起的無菌性炎癥顯著阻礙了其廣泛應用。目前為止，尚無一種支架材料能夠滿足組織工程化骨構建的所有要求。本實驗所用的支架材料新型CPC是上海瑞邦生物材料有限公司的專利產(chǎn)品（專利號：ZL 021508852），是將CPC經(jīng)過調(diào)整制備條件、漿體微結構、孔徑和孔隙率等然后改性而成。本研究旨在探索新型CPC支架材料對BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影響，為進一步的動物實驗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），地塞米松、β-磷酸甘油鈉、維生素C、茜素紅（alizarin red-S，ARS）（Sigma公司，美國），青霉素和鏈霉素（Hyclone公司，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（Sigma公司，美國）；新型CPC（上海瑞邦生物材料有限公司），PLGA、TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺，恒溫細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度，Thermo Forma公司，美國），一次性培養(yǎng)皿（Corning公司，美國），熒光顯微鏡（Hyclone公司，美國），倒置相差顯微鏡（inverted phase contrast microscope，IPCM）（Nikon公司，日本），紫外分光光度計（Beckman公司，美國）。

1.3 實驗動物

1～1.5歲健康Beagle犬，體重10～15 kg，雌雄不限，要求為一級實驗動物，由上海交通大學口腔醫(yī)學院動物中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的培養(yǎng)與誘導 在全麻和無菌條件下，用18號骨髓穿刺針筒于Beagle犬髂前上嵴抽取新鮮骨髓4～5 mL，迅速加入含肝素的無菌離心管中，1 500 r·min-1離心10 min，在超凈工作臺內(nèi)小心吸棄上層脂肪懸液，加入DMEM 20 mL吹打均勻后平均接種于兩個直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞在培養(yǎng)皿底部形成克隆時進行初次換液，細胞在培養(yǎng)皿底部融合超過70%～80%時首次傳代。從第1代開始，換用添加成骨細胞誘導體系（包括0.1 μmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-磷酸甘油鈉、50 μg·mL-1維生素C）的DMEM培養(yǎng)細胞[5]，選擇第2～3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.4.2 BMSCs與支架材料的體外復合培養(yǎng) 選擇第2～3代細胞，0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集、離心并調(diào)整細胞密度為每毫升1×106。滅菌支架材料分3組：A組為CPC，B組為TCP，C組為PLGA；另設單純培養(yǎng)細胞組作為對照（D組）。分別取支架材料預置于24孔板內(nèi)，根據(jù)材料吸水度預實驗的結果，每塊材料滴加150 μL細胞懸液，共同培養(yǎng)24 h后加常量培養(yǎng)基，于不同時間點進行后續(xù)檢測。

1.4.3 IPCM觀察 逐日觀察并記錄各組支架材料表面BMSCs外觀形態(tài)的變化及其貼壁、生長、擴增、分化、融合、鈣化等狀況。

1.4.4 生長曲線測定 細胞與支架材料共同培養(yǎng)后，每天從每組材料中取一塊材料用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞并調(diào)節(jié)成1 mL細胞懸液后進行細胞計數(shù)。每組材料重復操作3次取平均值，繪制生長曲線，并進行統(tǒng)計學分析。剩余孔每3天換液。

1.4.5 ALP活性半定量檢測 分別于共同培養(yǎng)7、10、14 d后將樣本從培養(yǎng)液中取出，消化收集細胞，加入裂解液200 μL裂解4～6 h，震蕩30 min后取10 μL放入96孔板中，每組設3個復孔，每孔加入200 μL蛋白質(zhì)分析液后震蕩5 min，630 nm處測光密度（optical density，OD）值。取100 μL細胞懸液放入96孔板，加入膠囊（ALP試劑盒里的固有組分）加緩沖液配成的反應底物100 μL，37℃水浴30 min后置于酶標儀上于405 nm波長下測定OD值。

1.4.6 骨鈣素ARS染色 分別于共同培養(yǎng)14、21 d后將各組材料樣本從培養(yǎng)液中取出，PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次，每次5 min，加0.1%ARS-Tris-HCl（pH值為8.3）于37℃水浴30 min，雙蒸水沖洗干凈多余染色劑后于光學顯微鏡下觀察鈣鹽沉積及鈣結節(jié)生成情況。

1.4.7 骨鈣素半定量檢測 分別于共培養(yǎng)14、21 d后將3組材料從培養(yǎng)液中取出，PBS沖洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS沖洗5次，每次5 min，0.5%ARSTris-HCl（pH值為4.0～4.2）室溫染色1 h后PBS孵育15 min，棄上清液后PBS沖洗3次，每次5 min，棄上清液后加入氯化十六烷基吡啶室溫下孵育30 min，吸上清液，定樣本的OD值（波長562 nm）。測定時用氯化十六烷基吡啶溶液調(diào)零，并同時測一組未加ARS的單純細胞的上清液OD值。樣本OD值=樣本OD測定值-單純細胞上清液OD值。每個樣本重復3次取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 17.0軟件對檢測結果進行方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 IPCM觀察

初次換液可見BMSCs呈圓形半透明狀，貼壁生長、增殖并形成散在克隆。BMSCs逐日增殖，約10 d后接近鋪滿培養(yǎng)皿底部，此時可進行首次傳代。換用誘導型DMEM培養(yǎng)后，細胞慢慢向梭形或多邊形轉化，偶有突起，形態(tài)類似成骨細胞。接種于不同材料上的細胞均可在材料表面黏附并生長，共同培養(yǎng)72 h后形態(tài)如下：CPC組BMSCs較為伸展，形態(tài)與單純培養(yǎng)組細胞相似；PLGA組BMSCs多為球形，生長狀態(tài)較差；TCP組BMSCs形態(tài)介于上述兩者之間，更接近于CPC組；散落在24孔板底壁細胞的生長形態(tài)與單純培養(yǎng)組細胞的鏡下形態(tài)相似（圖1）。

圖 1 共同培養(yǎng)72 h后BMSCs形態(tài) IPCM ×40Fig 1 Morphological characters of BMSCs cultured 72 h IPCM ×40

2.2 生長曲線測定

BMSCs接種于支架材料上后，部分黏附于材料上開始生長、增殖，部分漏出在培養(yǎng)板底壁繼續(xù)生長。細胞的生長曲線見圖2：黏附于材料上的細胞數(shù)量隨著時間的增加而增加，呈時間依賴性，7 d后進入平臺期，其后增長趨勢減慢；CPC組細胞數(shù)量最多，其次是TCP組，但兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PLGA組細胞數(shù)量最少，與其他兩組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。該結果提示CPC材料黏附的細胞最多、細胞增殖最快。

圖 2 BMSCs的生長曲線Fig 2 Growth curves of BMSCs

2.3 ALP活性半定量檢測

ALP活性半定量檢測結果見表1：CPC、TCP、PLGA組細胞均從7 d起表達出明顯的ALP活性，隨著培養(yǎng)時間的延長，ALP活性增強；CPC、TCP組ALP表達強度大于PLGA組，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但CPC與TCP組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表 1 ALP活性半定量測定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

表 1 ALP活性半定量測定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

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2.4 骨鈣素ARS染色

BMSCs在支架材料表面重疊生長，出現(xiàn)基質(zhì)堆積和礦鹽沉積現(xiàn)象。培養(yǎng)14 d時，鈣結節(jié)ARS染色可見深淺不一的淺紫紅色著色，表明有明顯的鈣鹽沉積；培養(yǎng)21 d時可見多個形態(tài)各異、大小不一的紫紅色結節(jié)，為鈣鹽沉積形成的鈣結節(jié)；隨著培養(yǎng)時間的延長，鈣結節(jié)逐漸增大（圖3）。無論是鈣鹽沉積還是鈣結節(jié)生成，CPC和TCP組均明顯多于PLGA組（P＜0.05），而CPC和TCP組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 3 3組的骨鈣素染色情況 ARS ×40Fig 3 Osteocalcin staining of three groups ARS ×40

2.5 骨鈣素半定量檢測

骨鈣素半定量檢測結果見圖4：14 d后各組細胞均有鈣鹽沉積，PLGA組鈣鹽沉積量明顯少于CPC和TCP組（P＜0.05），而TCP和CPC組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；21 d后各組細胞鈣鹽沉積量明顯增加，無論是鈣鹽沉積還是鈣結節(jié)生成，CPC和TCP組均明顯多于PLGA組（P＜0.05），而CPC和TCP組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。該結果與鈣結節(jié)ARS染色鏡下觀察結果一致。

圖 4 骨鈣素半定量檢測結果Fig 4 Semi-quantitative measurement of osteocalcin

3 討論

目前對骨組織工程中支架材料的研究熱點集中于以CPC和TCP為代表的多孔無機支架材料、PLGA與聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）等可降解材料及兩者的復合類材料[3-5]。20世紀80年代，Brown等[6]發(fā)現(xiàn)：某些磷酸鈣鹽能在人體環(huán)境和溫度下自行不放熱固化為羥磷灰石，由此開始將其嘗試用于骨缺損修復。本實驗選擇上海瑞邦生物材料有限公司生產(chǎn)的新型CPC作為支架材料，與PLGA和TCP進行比較。該材料利用成孔劑的微溶解和產(chǎn)氣劑的產(chǎn)氣在常溫下制備出多孔固化物，并針對傳統(tǒng)CPC抗壓強度不足、降解速率過慢等不足，調(diào)整材料的制備條件、漿體微結構、孔徑和孔隙率等，并加以改性制成，有孔徑大（為300～500 μm）、孔隙率高（約為70%）、抗壓強度接近骨松質(zhì)等特性，符合組織工程對于支架材料的要求。

對于種子細胞，不僅要求方便、易得，而且要求具有明確的成骨潛能[2-5]。目前已有多項關于脂肪干細胞、肌肉干細胞、牙髓干細胞、誘導多能干細胞等應用于骨組織工程的研究[7-9]，但BMSCs具有明確的多向轉化潛能，可以通過簡單的骨髓穿刺獲得，培養(yǎng)時可貼壁生長以避免接觸抑制，這些優(yōu)勢使其仍是重要的組織工程種子細胞之一。本實驗參考其他學者[10-12]的研究，采用經(jīng)典的全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法獲得具有干細胞特征的種子細胞，進行材料與細胞的復合實驗研究。

本實驗將CPC等支架材料與BMSCs體外共同培養(yǎng)，通過觀察細胞形態(tài)、繪制生長曲線，以及測定ALP和鈣結節(jié)等方法檢測新型CPC作為骨組織工程支架材料對BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影響。通過觀察細胞形態(tài)與生長曲線可以看出：黏附于新型CPC支架上的BMSCs形態(tài)較為伸展，與單純培養(yǎng)組細胞相似，表明CPC支架材料對BMSCs的生長沒有明顯影響；PLGA組表面細胞多為球形，生長狀態(tài)較差，可能是因為降解過程中的中間產(chǎn)物造成的無菌性炎癥以及局部pH值的劇烈變化等原因阻礙了BMSCs的黏附與增殖；TCP組細胞形態(tài)和生長曲線都接近于CPC組，兩組沒有明顯差異，說明TCP對BMSCs的黏附、生長影響較小。

ALP是成熟骨細胞的早期標志物[13]。本研究ALP檢測結果表明：雖然CPC、TCP、PLGA組細胞均從培養(yǎng)第7天起明顯表達ALP活性，隨著時間增長活性均增強，但每個時間點CPC與TCP組細胞的ALP表達強度均大于PLGA組（P＜0.05），而CPC與TCP組之間則無明顯差異（P＞0.05）。鈣結節(jié)是成骨細胞分化成熟的標志，由鈣鹽逐步沉積而形成，一般鈣化早期開始表達，成熟后達高峰[14]。本實驗ARS染色結果同樣表明：無論是鈣鹽沉積還是鈣結節(jié)生成，CPC組和TCP組均明顯多于PLGA組，而CPC組和TCP組之間沒有顯著差異。鈣結節(jié)隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，半定量檢測結果顯示：PLGA組鈣結節(jié)形成明顯少于CPC組和TCP組，而TCP組與CPC組無明顯差異。這一結果與ARS染色結果一致。

支架材料是細胞黏附、生長和礦化的場所。理想的骨支架材料要求具備以下特征：1）良好的生物相容性和表面活性，周圍組織炎性反應小；2）具有可控且適宜的生物降解速度，最好與骨的生理性生成相匹配；3）具有合適的孔徑、適當?shù)目紫堵屎蜐B透性；4）具有良好的骨傳導性和骨誘導性；5）材料表面有利于細胞黏附和增殖[15]。本實驗選用的新型CPC孔徑為300～500 μm，孔隙率約70%，且孔與孔之間互相連通，呈現(xiàn)較為規(guī)則的三維多孔隙立體結構，符合骨組織工程支架材料的要求。與BMSCs共同培養(yǎng)后，經(jīng)多項檢測也表明：新型CPC材料為種子細胞的爬行長入、黏附、增殖及成骨作用的發(fā)揮提供了良好的三維空間環(huán)境。這也證明了BMSCs作為干細胞的成骨分化潛能和在組織工程化骨的構建中作為種子細胞的可行性。

本實驗結果證明：新型CPC支架材料可以為種子細胞的生長提供適宜的局部環(huán)境，BMSCs可以在材料表面黏附、增殖、分化并發(fā)揮其成骨潛能。在現(xiàn)有的骨組織工程技術條件下，可以通過對Beagle犬BMSCs進行體外培養(yǎng)、誘導、擴增，并與新型CPC支架材料共同培養(yǎng)構建三維組織工程化骨。但就最終的體內(nèi)植入而言，該類CPC材料還存在脆性較大、骨引導和骨誘導性不足等缺陷，應用基因重組、復合生長因子等高新技術以體外構建具有骨引導性和骨誘導性的真正意義上的三維結構組織工程化骨尚需要更為深入的研究[11-12]。

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