吳志華，楊巧麗，李天會，張 婧，謝耀堅

(國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東湛江524022)

桉樹(Eucalyptus)是我國南部地區(qū)廣泛種植的重要人工林樹種［1］，除作為速生豐產(chǎn)林生產(chǎn)木材外，其葉可入藥，是我國廣西、云南和四川等地常用的中藥材;由桉葉油(桉葉蒸餾所得精油)中分離提純的1，8-桉葉油素，可以治療流感、咳嗽、腸炎、痢疾、風濕骨痛、濕疹、神經(jīng)性皮炎等［1-2］。醫(yī)藥、化工上利用的主要桉葉品種是富含桉葉油素的主藍桉(Eucalyptus globulus)和檸檬桉(E.citriodora)等少數(shù)幾個種，而作為我國桉樹主栽品種之一的尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)，因其含1，8-桉葉油素精油的含量相對較低被廢棄，未得到有效利用。目前研究中多針對桉葉精油成分，也有對桉葉黃酮類化合物［3］、鞣質及酚類［4-5］等成分的分析報道。國內(nèi)外有關分析桉葉脂肪酸組成成分的報道中，多與抗寒性有關［6-8］，而關于桉葉片脂肪酸資源和利用方面的報道不多。目前脂肪酸分析測檢方法以氣相色譜-質譜(GC-MS)居多，在色譜條件中如程序升溫初始溫度和升溫速率對成分分離快慢和分離好壞有直接關系，因此色譜條件是否能滿足分析需求還存在疑問。響應面法(RSM，response surface methodology)通過一系列確定性的“實驗”擬合響應面來模擬真實極限狀態(tài)曲面，從而很容易地進行可靠性分析，因其具備經(jīng)濟性、實驗次數(shù)少和實驗時間較短等特點［9］，廣泛用于實驗參數(shù)優(yōu)化過程中［10］。本研究在前期基礎上，以超聲波獲得的尾巨桉DH32-29葉片脂肪酸提取物為材料，對脂肪酸組成成分檢測中GC-MS色譜條件進行了優(yōu)化實驗，旨在建立行之有效的桉葉脂肪酸的檢測方法，為桉葉資源評估以及開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桉葉 來源于尾巨桉DH32-29，為2年生健康植株樹冠中部的葉片，2011年4月12日于廣東湛江市遂溪的南方國家級種苗基地內(nèi)所采集;石油醚、正己烷、甲醇、濃硫酸、無水硫酸鈉 均為分析純。

JJ-2型組織破碎機 江蘇省金壇市金南儀器廠;KQ5200DE超聲波處理器 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;N-1100S-W旋轉蒸發(fā)儀 日本EYELA公司;Agilent 7890GC-5975MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2 粗脂的提取

桉葉經(jīng)風干后，70℃烘干1h，過0.5mm篩粉碎備用。提取方法參照文獻［11］實施:取干燥桉葉粉(80～150 目)10g，加入石油醚(沸點60～90℃)80mL，浸泡10～12h，進行超聲波萃取(頻率為40kHz、溫度為30℃)，萃取3次，每次20min，溶液過濾后，加入20mL石油醚(沸點60～90℃)沖洗濾渣，再次過濾，濾液合并后經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收石油醚，得到桉葉粗脂，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 脂肪酸甲酯化處理

采用1%硫酸-甲醇酯化法［12］:取粗脂0.5g于具塞三角瓶中，加入1%硫酸-甲醇溶液20mL，充分振蕩，50～60℃水浴1h，靜置后加入20mL正己烷，振蕩均勻，靜置15min，取上層萃取液離心，將離心后的上清液作為分析試樣。

1.4 GC－MS條件

1.4.1 色譜條件優(yōu)化實驗 HP-5MS 30m×0.25mm×0.25μm石英彈性毛細管柱，載氣為高純氦氣，進樣口溫度 260℃，流速 1mL/min，進樣量 1.0μL，分流比20∶1。在程序升溫常規(guī)參數(shù)［11］基礎上，分別就色譜條件程序升溫中的8個因素進行了最優(yōu)響應面設計(D-optimal Algorithm)［13］，得 55 個處理組合。實驗因素編碼與水平見表1，處理組合見表2。

表1 實驗因素編碼與水平Table 1 Factors with different levels in the D-optimal RSM experiment

表2 實驗處理組合Table 2 Factors combination of experimental treatments in the D-optimal RSM experiment

1.4.2 質譜條件 EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，EM電壓1024V，質量掃描范圍40～600u。

1.4.3 定性與定量分析 根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)利用NIST08譜圖庫進行自動檢索，并結合人工圖譜解析，對提取物成分進行定性分析。采用色譜峰面積歸一化法確定各成分的相對百分含量。

1.5 統(tǒng)計指標和建模分析

以脂肪酸成分的相對含量(Y1)、脂肪酸種類數(shù)(Y2)、Simpson指數(shù)(Y3，可檢測出的成分種類的多樣性指數(shù))、離子譜圖質量(Y4)(根據(jù)的色譜圖峰的分離度、分布等分成3級，1級別表示色譜圖譜差，峰分離不清晰、不均勻，拖尾、甚至出現(xiàn)基線漂移，2級別表示譜圖分離效果一般，3級別表示譜圖質量好，以0表示不能實施的處理組合)為評價指標進行分析統(tǒng)計，采用Design-Expert 7.0軟件進行建模分析。

2 結果與分析

2.1 桉葉脂肪酸相對含量

分別對尾巨桉 DH32-29無性系桉葉粗脂進行GC-MS處理分析(圖1)，對分離出來的脂肪酸相對含量進行統(tǒng)計，除不能實施的處理號19、28、29、31、37、46、48、52 外，平均相對含量達到 72.3%以上，最小值為57.0%(處理號21)，處理號33達到最大值86.9%。

圖1 不同GC-MS條件下檢測出的脂肪酸情況Fig.1 The content，kind，Simpson index and TIC of fatty acids under the different GC-MS conditions

分別對甲酯化的尾巨桉葉片粗脂進行不同的程序升溫條件下分析檢測，以Design-Expert進行正交實驗建模分析，得到有效Y1回歸模型方程(R2=0.863，p=6.4×10-3)如下:

注:式(1)中，Y1為脂肪酸成分的相對含量，A-H因子前的各數(shù)字為標準化的回歸系數(shù)，其中因素后的*、＊＊分別表示在0.05、0.01水平上差異。

從式(1)可知，對于脂肪酸成分的相對含量(Y1)來說，因子主效應中，因子C(升溫速率1)中回歸系數(shù)絕對值最大為11.69，其次為因子F的回歸系數(shù)(7.89)，因子G的回歸系數(shù)絕對值為6.80，因子E的回歸系數(shù)絕對值為6.39，這4個因子影響均達到顯著水平以上，而因子B回歸系數(shù)絕對值最小為4.31，因此影響桉葉提取物分離檢測的的因素從大到小依次為:C＞F＞G＞E＞A＞H＞B＞D，也就是說，升溫速率1(V1)對桉葉提取物中脂肪酸粗脂檢測影響最大，其次是升溫速率2(V2)、最后溫度Tf、第二次保留時間(t2)、初始溫度(T0)、最后保留時間、第一次保留時間、中間溫度。在因子主效應中，除因子C起到正向效應外，其他的均為反向效應，即隨著因子增大Y1相應減少。除此之外，因子 BC、BF、BH、CH、EF之間均存在著明顯的交互作用。

2.2 脂肪酸成分分析

對尾巨桉DH32-29無性系桉葉粗脂進行GC-MS處理分析(圖1B)，除沒有實施的處理號，共分離出脂肪酸(十四酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸、二十四酸、二十六酸、二十八酸)甲脂產(chǎn)物10個峰，平均獲得檢測出5種脂肪酸，其中處理號11和17可鑒定10種脂肪酸。因此不同的處理組合之間差異較大，對脂肪酸成分含量來說是顯著性的。對脂肪酸種類數(shù)與各影響因子進行建模分析，得到有效Y2回歸模型方程(R2=0.881，p=2.3×10-3)如下:

從(2)式可知，對于脂肪酸成分種類數(shù)(Y2)，因子C(升溫速率1)是最主要的影響因子，其次為因子E(第二次保留時間t2)，影響均達到極顯著水平。因子 BC、BD、BH、CF、DH、EF 均存在著明顯的因子交互影響。

2.3 脂肪酸成分的Simpson指數(shù)

Simpson指數(shù)為描述分類變量總體多樣性大小的指數(shù)，多用于群體多樣性計算，其公式為:D=1-ΣPi2(式中Pi種的個體數(shù)占群體中總個體數(shù)的比例)，反映了一個群體的優(yōu)異性，當總體的分類數(shù)增多時，相應的多樣度增大，本實驗以此分析脂肪酸成分的差異。分別以脂肪酸不同種類以及相對含量，計算脂肪酸成分的Simpson指數(shù)(Y3)，結果如圖1C。

大部分處理號的Simpson指數(shù)分別在0.4左右(平均值為0.3790±0.039)，不能實施的處理號(19、28、29、31、37、46、48、52)的 Simpson 指數(shù)為最大值1，而處理號32最小(0.02)。

從式(3)可知，對脂肪酸成分Simpson指數(shù)(Y3)影響比較大的主效應因子為F、G、C，在交互作用中影響的因子分別為AE、BF、CH。

2.4 譜圖質量(Y4)

根據(jù)不同處理的脂肪酸離子流色譜圖進行峰的分離度、分布的評估，結果如圖1D。離子譜圖質量(Y4)除了處理號 19、28、29、31、37、46、48、52 為 0外，大部分處理號平均Y4為2級，只有處理號1、7、43達到3級。對Y4影響因子進行逐步回歸分析(stepwise regression)，得到有效Y4平方根的回歸模型方程(R2=0.710，p＜1.0×10-4)。

從式(4)可知，因子C、G、E是影響Y4的重要的因子，其中升溫速率(C)的影響最大。

2.5 桉葉脂肪酸最優(yōu)GC－MS條件確定

先由桉葉脂肪酸含量、成分種類數(shù)、脂肪酸成分的Simpson指數(shù)以及GC-MS離子流色譜圖質量4個指標按照等比權重和脂肪酸成分種類數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，譜圖質量等級越高的要求構建桉葉脂肪酸GC-MS綜合指標，在上述分析以及擬合模型的基礎上進行RSM優(yōu)化分析，最后獲得最優(yōu)因子組合期望值較高的為10個(表3)。從優(yōu)化的結果來看，在優(yōu)化方案1中GC-MS條件下，理論上可以獲得脂肪酸成分的相對含量86.9%、可檢測脂肪酸成分為8種(Y2)、Simpson指數(shù)為0.16，離子流譜圖質量為2.4等級。分別以兩種方法(優(yōu)化前的常規(guī)參數(shù)和獲得最優(yōu)化參數(shù))對16個不同提取方法獲得尾赤桉WC3桉葉提取物進行驗證分析比較(表3)，結果表明在優(yōu)化獲得的參數(shù)下，桉葉脂肪酸含量、成分種類數(shù)、脂肪酸成分的Simpson指數(shù)上均顯著優(yōu)于優(yōu)化前常規(guī)參數(shù)條件，能獲得滿意的結果(如圖2)。

表3 桉葉脂肪酸分析GC-MS優(yōu)選組合以及驗證比較Table 3 The optimum GC-MS conditions for fatty acids analysis of Eucalyptus leaf and the tested resluts

圖2 在優(yōu)化GC-MS條件下尾赤桉WC3桉葉提取物離子圖Fig.2 TIC of the fatty acid in E.urophylla×E.camaldulensis WC3cloneleaves

3 結論

3.1 以超聲波法對尾巨桉葉脂肪酸成分時，檢測所得的桉葉脂肪酸相對含量比較高(到達72.3%)，脂肪酸成分種類平均可檢測出5種脂肪酸，最大可以可獲得10種脂肪酸成分，這與以前報道的一致［11］，即桉葉中脂肪酸含量豐富。

3.2 GC-MS色譜條件對脂肪酸分析檢測影響顯著。程序升溫中的升溫速率對脂肪酸成分分離起到關鍵性的作用，不但影響分離快慢，也直接影響分離好壞。從本研究結果表明，對尾巨桉葉片脂肪酸成分檢測影響最大的因素是升溫速率V1。

3.3 通過D-optimal響應面法對色譜條件重要因子進行實驗，共設計處理組合55個，盡管其中有8個不能實施的處理組合，但因實驗設計中考慮到這點(其中5個為防缺失處理組合，5個為重復處理組合)，因此所獲得的回歸模型均有效。最優(yōu)GC-MS色譜條件為:初始溫度(80℃)、第一次保留時間(1.1min)、升溫速率1(17℃/min)、中間溫度(240℃)、第二次保留時間(0.7min)、升溫速率2(1℃/min)、最后溫度(253℃)、最后保留時間(4min)。實驗驗證表明所獲結果可行。

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