劉立萍， 任艷玲*， 李 然， 王智民， 蒿長(zhǎng)英， 宋 囡

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

絕經(jīng)后婦女易患骨質(zhì)疏松癥，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治日益受到人們的關(guān)注，現(xiàn)代研究表明中醫(yī)藥在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物治療方面取得了不少成果，中醫(yī)藥臨床治療以“補(bǔ)腎”為法，能提高骨量，緩解或消除癥狀，并起到綜合治療目的［1］。中成藥左歸丸具有滋腎補(bǔ)陰功效，本課題組前期研究結(jié)果表明左歸丸對(duì)去卵巢所致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠有一定的防治作用［2］，為了進(jìn)一步探討左歸丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)探討JNK信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清調(diào)控MC3T3成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1 Subclone 14，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。MC3T3成骨細(xì)胞用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每周換2次培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.3 藥物與試劑 左歸丸 (上海雷允上封浜制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020371);倍美力結(jié)合雌激素片 (愛(ài)爾蘭惠氏藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字J20050120);SP600125(Sigma);PNPP(Sigma);茜素紅(Sigma);抗ALP抗體 (博士德);抗GAPDH抗體(北京中杉)。

1.4 主要儀器 iMark型酶標(biāo)儀 (Bio-Rad);Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng) (Bio-Rad);EC3凝膠成像儀 (UVP)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組、左歸丸組、倍美力組，20只/組。根據(jù)人與大鼠等劑量換算公式折算大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g/kg體質(zhì)量，倍美力為56.25 μg/kg。藥物灌服10 mL/kg，空白對(duì)照組灌服蒸餾水，2次/d，于第8天給藥2 h后，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清，56℃滅活30 min。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 依據(jù)不含或含JNK特異抑制劑SP600125(10 μmol/L)，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、SP600125組、左歸丸組、左歸丸加SP600125組、倍美力組、倍美力加SP600125組。

2.3 細(xì)胞抑制劑預(yù)處理及給藥 細(xì)胞接種24 h后，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含或含10 μmol/L SP600125的α-MEM培養(yǎng)液預(yù)處理60 min后，各組加入終濃度為15%的相應(yīng)含藥血清孵育。

2.4 堿性磷酸酶活性測(cè)定 細(xì)胞以1×105接種于48孔培養(yǎng)板，抑制劑預(yù)處理及給藥，孵育48 h后，0.1%Triton X-100裂解液4℃作用過(guò)夜，反復(fù)凍融3次，冰水浴內(nèi)超聲，收集裂解液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用PNPP法測(cè)定ALP活性，測(cè)定孔內(nèi)加入基質(zhì)溶液 (2 mol/L二乙醇胺緩沖液，PNPP)，37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上415 nm測(cè)定吸光度 (A)。

2.5 改良鈣鈷法染色 細(xì)胞以1×105接種于24孔板，抑制劑預(yù)處理及給藥，孵育7 d，每3天換1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，加入孵育液 (2%氯化鈣20 mL、2%巴比妥鈉10 mL、3%β-甘油磷酸鈉10 mL、5%硫酸鎂5 mL、蒸餾水 5 mL)，37℃ 孵育4 h，去離子水沖洗，2%硝酸鈷溶液5 min，去離子水沖洗，1%硫化銨溶液1 min，去離子水沖洗。

2.6 茜素紅染色 細(xì)胞以1×105接種于24孔板，抑制劑預(yù)處理及給藥，孵育14 d，每3天換1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，0.1%茜素紅-Tris-Hcl(pH8.3)，37℃，避光孵育30 min，去離子水沖洗。

2.7 Western blot分析 細(xì)胞以2×106接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，抑制劑預(yù)處理及給藥，孵育48 h。提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min，蛋白上樣60 μg/孔，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2 h，ECL發(fā)光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用quantity one軟件分析，掃描光密度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件處理，用One-Way ANOVA進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示。

3 結(jié)果

3.1 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞48 h ALP活性的影響 由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強(qiáng)MC3T3細(xì)胞ALP活性 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對(duì)孵育48 h的ALP活性影響不顯著，左歸丸組優(yōu)于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對(duì)抗倍美力含藥血清對(duì)ALP活性的誘導(dǎo) (P＜0.01)。

圖1 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞48 h ALP活性的影響(±s，n=5)Fig.1 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pill-induced ALP activity within 48 h in MC3T3 cells(±s，n=5)

3.2 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞7 d ALP活性的影響 由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強(qiáng)MC3T3細(xì)胞ALP活性 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對(duì)孵育7 d的ALP活性誘導(dǎo)明顯減弱 (P＜0.01)，且左歸丸組優(yōu)于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對(duì)抗倍美力含藥血清對(duì)ALP活性的誘導(dǎo) (P＜0.01)。

3.3 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞14 d礦化作用的影響 由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強(qiáng)MC3T3細(xì)胞礦化作用 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對(duì)孵育14 d的礦化作用誘導(dǎo)明顯減弱 (P＜0.01)，且左歸丸組優(yōu)于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對(duì)抗倍美力含藥血清對(duì)礦化作用的誘導(dǎo) (P＜0.01)。

圖2 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞7 d ALP活性的影響(±s，n=3)Fig.2 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced ALP activity within 7 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

圖3 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞14 d礦化作用的影響(±s，n=3)Fig.3 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced mineralization within 14 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

3.4 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)的影響 由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著上調(diào)MC3T3細(xì)胞ALP蛋白的表達(dá)水平 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對(duì)孵育48 h的ALP蛋白表達(dá)的影響不顯著，左歸丸組優(yōu)于倍美力組 (P＜0.01);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對(duì)抗倍美力含藥血清對(duì)ALP蛋白表達(dá)的上調(diào)作用 (P＜0.01)。

圖4 JNK抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.4 Effect of of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced expression of ALP protein in MC3T3 cells(±s，n=3)

4 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是以絕經(jīng)后婦女骨量減少，易發(fā)生骨折為主要特征的病癥，治以補(bǔ)腎、健脾等法，多選用補(bǔ)益劑，尤以入腎經(jīng)最多［3］。具有補(bǔ)腎作用的中成藥發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松作用［4］，滋補(bǔ)腎陰對(duì)腎陰虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療效果確切［5］，左歸丸(《景岳全書(shū)》)為滋陰補(bǔ)腎之常用方劑，現(xiàn)代研究表明左歸丸能夠有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥［6-7］。

成骨細(xì)胞分化是骨形成的重要部分，其特異性標(biāo)志有ALP表達(dá)，Ⅰ型膠原積累，骨鈣素產(chǎn)生，骨基質(zhì)礦化。骨形成時(shí)成骨細(xì)胞可分泌大量ALP，ALP活性可以反映成骨細(xì)胞的活躍狀況［8］，骨礦化階段主要是鈣和磷酸鹽合成［9］。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示左歸丸含藥血清既能顯著誘導(dǎo)MC3T3細(xì)胞分化前期的ALP活性，上調(diào)ALP蛋白表達(dá)水平，又能刺激成骨細(xì)胞分化末期的礦化結(jié)節(jié)形成，促進(jìn)MC3T3成骨細(xì)胞分化。

促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號(hào)通路對(duì)于MC3T3成骨細(xì)胞連續(xù)分化起著重要作用，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)誘導(dǎo)JNK蛋白磷酸化［10］，活化JNK參與BMP-2誘導(dǎo)的骨基質(zhì)礦化［11］，SP600125阻 滯 JNK 通 路，顯 著 抑 制MC3T3成骨細(xì)胞分化末期礦化作用，對(duì)成骨細(xì)胞分化早期階段ALP活性表達(dá)影響不顯著［12］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明SP600125阻滯JNK通路，對(duì)左歸丸含藥血清孵育48 h誘導(dǎo)的MC3T3成骨細(xì)胞分化前期的ALP活性和ALP蛋白表達(dá)的影響不顯著，對(duì)孵育7 d的ALP活性和14 d的礦化結(jié)節(jié)的影響顯著。結(jié)果提示左歸丸含藥血清誘導(dǎo)MC3T3成骨細(xì)胞分化末期尤其依賴JNK通路促進(jìn)骨形成，這可能是左歸丸防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一，對(duì)于左歸丸含藥血清誘導(dǎo)MC3T3成骨細(xì)胞分化前期ALP活性是否主要通過(guò)p38或ERK通路值得進(jìn)一步研究。

［1］劉建寧，王 曄.中醫(yī)藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥概況［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，(4):465-466.

［2］呂海波，任艷玲，王 瑩，等.左歸丸防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2010，16(11):847-850.

［3］李中偉，許 勇.中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松的理論基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18(12):71-73.

［4］陳曉飛，陳素紅，呂圭源.補(bǔ)腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥機(jī)制研究及探討［J］.中成藥，2011，33(7):1130-1134.

［5］俞益火，陳久毅，王 建.二至丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2011，19(4):42-43.

［6］鞠大宏，劉梅潔，趙宏艷，等.左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(5):312-315.

［7］劉梅潔，潘靜華，李 艷，等.左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中BGP，IGF-Ⅰ含量的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(16):133-136.

［8］楊榮平，壽清耀，涂永勤，等.補(bǔ)骨脂提取物對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1):32-34.

［9］Hakki S S，Bozkurt B S，Hakki E E.Boron regulates mineralized tissue-associated proteins in osteoblasts(MC3T3-E1)［J］.J Trace Elem Med Biol，2010，24(4):243-250.

［10］Tokuda H，Takai S，Hanai Y，et al.Potentiation by platelet-derived growth factor-BB of FGF-2-stimulated VEGF release in osteoblasts［J］.J Bone Miner Metab，2008，26(4):335-341.

［11］Suzuki A，Ghayor C，Guicheu J，et al.Enhanced expression of the inorganic phosphate transporter Pit-1 is involved in BMP-2-induced matrix mineralization in osteoblast-like cells［J］.J Bone Miner Res，2006，21(5):674-683.

［12］Matsuguchi T，Chiba N，Bandow K，et al.JNK activity is essential for Atf4 expression and late-stage osteoblast differentiation［J］.J Bone Miner Res，2009，24(3):398-410.