王呈偉，鄭玉紅，李瑩，陸波，彭峰，①，陳曉萱

〔1.江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇南京210014;2.江蘇大千生態(tài)景觀股份有限公司，江蘇 南京 210024〕

曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力檢測條件優(yōu)化和適宜儲(chǔ)藏溫度分析

王呈偉1，鄭玉紅1，李瑩1，陸波1，彭峰1，①，陳曉萱2

〔1.江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇南京210014;2.江蘇大千生態(tài)景觀股份有限公司，江蘇 南京 210024〕

采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對適宜于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’(Taxus media‘Hicksii’)花粉活力檢測的TTC染色法和離體培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了選擇，并采用優(yōu)化條件研究了在25℃～－196℃條件下儲(chǔ)藏13周花粉活力的變化。結(jié)果表明:采用TTC染色法測定的花粉活力均高于離體培養(yǎng)法。在TTC染色法的3個(gè)影響因素(染液pH、TTC濃度和染色溫度)中，染液pH對檢測結(jié)果有極顯著影響，而染色溫度和TTC濃度則無顯著影響，但溫度對染色速率有影響。在離體培養(yǎng)法的3個(gè)影響因素(培養(yǎng)基中蔗糖添加量、H3BO3和Ca(NO3)2濃度及培養(yǎng)溫度)中，蔗糖添加量對檢測結(jié)果有極顯著影響，在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖的培養(yǎng)基上花粉活力最高，而在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20%和25%蔗糖的培養(yǎng)基上花粉均不能萌發(fā);在含100和200 mg·L－1H3BO3的培養(yǎng)基中添加200 mg· L－1Ca(NO3)2均能顯著提高花粉活力;培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)速率有影響但對花粉活力沒有明顯影響。TTC染色法的最優(yōu)檢測條件為:用5.0 g·L－1TTC染液(pH 7.0)在35℃下染色2.0 h;離體培養(yǎng)法的最優(yōu)檢測條件為:用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖、100 mg·L－1H3BO3和200 mg·L－1Ca(NO3)2的培養(yǎng)基暗培養(yǎng)4 d。在25℃、4℃、0℃、－20℃、－80℃和－196℃條件下儲(chǔ)藏13周，‘Hicksii’花粉活力和保持時(shí)間有明顯差異，其中，于－80℃和－196℃儲(chǔ)藏3 d花粉就喪失活力;于25℃和－20℃儲(chǔ)藏7周、4℃儲(chǔ)藏10周，花粉仍有一定的活力;而在0℃條件下花粉活力最高，且儲(chǔ)藏11周花粉仍有活力。推測曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉對低溫的抗性較差，0℃為其適宜的儲(chǔ)藏溫度。

曼地亞紅豆杉‘Hicksii’;花粉活力;TTC染色法;離體萌發(fā)法;儲(chǔ)藏溫度

紅豆杉是紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(TaxusL.)植物的統(tǒng)稱，具有四季常綠、假種皮顏色鮮艷、枝型優(yōu)雅、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在多種氣候和土壤條件下生長良好，是理想的觀賞植物。1971年，Wani等從短葉紅豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)中分離得到抗癌活性成分紫杉醇(taxol)［1］，該成分是繼阿霉素、順鉑之后對癌癥治療療效最好、副作用最小的藥物，因此，紅豆杉還具有很高的藥用價(jià)值。曼地亞紅豆杉(T.mediaRehd.)原產(chǎn)美國和加拿大，具有生物量大、生長迅速及耐低溫等特點(diǎn)，在中國大部分地區(qū)均可栽種。‘Hicksii’是曼地亞紅豆杉的1個(gè)栽培品種，目前，本項(xiàng)目組已針對不同栽培條件對其枝葉中紫杉醇含量的影響進(jìn)行了相關(guān)研究［2－3］。

花粉生活力主要受植物自身遺傳特性和外界因素的影響，其中溫度的影響尤為重要［4］?；ǚ蹆?chǔ)藏不但可用于保存種質(zhì)，同時(shí)還可以解決雜交過程中父本與母本花期不遇或者異地雜交的問題。程廣有等［5］采用TTC染色法研究了35℃～－10℃儲(chǔ)藏條件下東北紅豆杉(T.cuspidataSieb.et Zucc.)的花粉壽命，結(jié)果顯示低溫可以延長東北紅豆杉的花粉壽命，但對－20℃甚至超低溫條件對花粉壽命的影響未加以研究。

作者首先對適宜于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力檢測的TTC染色法和離體培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用優(yōu)化條件對在室溫(25℃)、4℃、0℃、－20℃、－80℃和－196℃條件下儲(chǔ)藏13周的曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉活力進(jìn)行比較，以期篩選出適宜于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉的儲(chǔ)藏溫度，為其育種和繁殖提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

曼地亞紅豆杉‘Hicksii’于2002年由美國俄勒岡州引種至南京并栽植于江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所實(shí)驗(yàn)苗圃，于2010年3月7日采集花粉。選擇花藥開裂且新鮮呈白色的雄花，將花粉抖落并收集到EP管中，室溫下自然干燥24 h;采用烘干法檢測花粉含水量，含水量達(dá)到約35%時(shí)儲(chǔ)藏備用。

1.2 方法

1.2.1 花粉活力檢測條件的優(yōu)化參照文獻(xiàn)［6－7］設(shè)置TTC染色的方法和基本條件(5.0 g·L－1TTC，pH 7.0;染色溫度35℃)，并對染液pH、TTC濃度和染色溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)篩選。其中，染液pH設(shè)3個(gè)水平:pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0;TTC濃度設(shè)3個(gè)水平:2.5、5.0和10.0 g·L－1;染色溫度設(shè)3個(gè)水平:25℃、30℃和35℃。將適量TTC溶液滴于載玻片上，用棉棒蘸取花粉并抖落于液滴中，于不同溫度下進(jìn)行暗培養(yǎng)。用Nikon ECLIPSE 80I顯微鏡觀察并拍照，每隔0.5 h觀察1次;每處理3個(gè)玻片，每個(gè)玻片隨機(jī)觀察5～10個(gè)視野。對有活力和無活力的花粉數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以花粉總數(shù)超過200為宜，結(jié)果取平均值。

參照文獻(xiàn)［8－9］設(shè)置花粉離體培養(yǎng)的方法和基本條件(培養(yǎng)基含100 mg·L－1H3BO3、200 mg· L－1Ca(NO3)2和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖，培養(yǎng)溫度35℃)，并對培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)、H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)篩選。其中，蔗糖質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)設(shè)4個(gè)水平:10%、15%、20%和25%;H3BO3和Ca (NO3)2質(zhì)量濃度設(shè)4個(gè)組合:100 mg·L－1H3BO3－0 mg·L－1Ca(NO3)2、200 mg·L－1H3BO3－0 mg· L－1Ca(NO3)2、100 mg·L－1H3BO3－200 mg·L－1Ca(NO3)2、200 mg·L－1H3BO3－200 mg·L－1Ca (NO3)2;培養(yǎng)溫度設(shè)3個(gè)水平:25℃、30℃和35℃。用棉棒蘸取花粉并抖落于不同的培養(yǎng)基上，于不同溫度下進(jìn)行暗培養(yǎng)。用Nikon ECLIPSE 80I顯微鏡觀察花粉管的生長情況并拍照，每隔12 h觀察1次;每處理3個(gè)玻片，每個(gè)玻片隨機(jī)觀察5～10個(gè)視野。以花粉管萌發(fā)作為判別花粉有活力的標(biāo)準(zhǔn)，對有活力和無活力的花粉數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以花粉總數(shù)超過200為宜，結(jié)果取平均值。

1.2.2 儲(chǔ)藏溫度對花粉活力的影響將花粉分別于室溫(25℃)、4℃、0℃、－20℃、－80℃和－196℃條件下儲(chǔ)藏13周，每周測定1次花粉活力。其中，花粉在－80℃儲(chǔ)藏和取出時(shí)要經(jīng)過－20℃和0℃各6 h的緩沖處理［10］，花粉在－196℃儲(chǔ)藏和取出時(shí)則要經(jīng)過－80℃、－20℃和0℃各6 h的緩沖處理。采用優(yōu)化的TTC染色法和離體培養(yǎng)法同步測定花粉活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

花粉活力的計(jì)算公式為:花粉活力=〔有活力的花粉數(shù)/(有活力的花粉數(shù)+無活力的花粉數(shù))〕× 100%。使用SPSS 13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 花粉活力檢測方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用TTC染色法和離體培養(yǎng)法檢測曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力均有良好效果(圖1)。TTC染色后，有活力花粉被染成紅色，無活力花粉不變色(圖1－1);此外，有一些花粉因?yàn)榛盍Σ蛔愣a(chǎn)生輕微的變色。通過離體培養(yǎng)，有活力的花粉均可觀察到花粉管的萌發(fā)(圖1－2)。

圖1 TTC染色和離體培養(yǎng)后曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉的形態(tài)Fig.1 Pollen morphology of Taxus media‘Hicksii’by TTC staining and in vitro culture

2.1.1 TTC染色法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1.1 pH的選擇采用不同pH的5.0 g· L－1TTC在35℃條件下測定曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉活力，結(jié)果見表1。由表1可見:采用pH 7.0的TTC染液進(jìn)行染色，測得的花粉活力高于pH 6.0和pH 6.5的TTC染液，差異極顯著(P=0.01)。用pH 7.0的TTC染液染色0.5 h花粉活力為73.37%，染色2.0 h的花粉活力達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(92.30%)，可以進(jìn)行計(jì)數(shù)。而用pH 6.0和pH 6.5的TTC染液分別染色3.5 h，測得的花粉活力分別為45.78%和74.99%?？傮w上看，采用pH 7.0的TTC染液染色速度最快，測得的花粉活力也明顯高于pH 6.0和pH 6.5的TTC染液。

2.1.1.2 染色溫度的選擇分別在25℃、30℃和35℃條件下采用pH 7.0的5.0 g·L－1TTC染液進(jìn)行染色，曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉活力沒有明顯差別，均達(dá)到90%以上，但是染色所需時(shí)間卻差別很大。25℃、30℃和35℃條件下花粉活力達(dá)到45%所需的染色時(shí)間分別為2.0、1.0和0.5 h;而花粉活力達(dá)到90%所需的時(shí)間分別為6.0、3.5和2.0 h。比較而言，在35℃條件下染色速度最快。

表1 用不同pH的TTC染液染色后曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 1 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’by TTC staining solution with different pH±SD)1)

表1 用不同pH的TTC染液染色后曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 1 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’by TTC staining solution with different pH±SD)1)

1)同列中不同的大寫和小寫字母分別表示差異極顯著(P=0.01)或顯著(P=0.05)Different capitals and small letters in the same column indicatethe extremely significant(P=0.01)or significant(P=0.05)differences，respectively.

pH不同染色時(shí)間的花粉活力/%Pollen viability at different staining times 0.5 h1.0 h1.5 h2.0 h2.5 h3.0 h3.5 h 6.013.75±3.36cC16.11±1.46cC24.04±1.75cC27.71±2.41cC37.48±0.67cC40.86±5.60cC45.78±1.56cC 6.527.19±2.56bB45.71±4.80bB55.44±5.56bB60.68±2.25bB69.09±3.13bB73.60±3.71bB74.99±3.22bB 7.073.37±3.06aA79.90±2.95aA85.14±1.90aA92.30±2.42aA92.51±1.41aA91.09±1.61aA90.70±0.61aA

2.1.1.3 TTC濃度的選擇在pH 7.0、35℃的條件下采用不同濃度TTC染液染色，曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉活力檢測結(jié)果差異較小，僅染色效果略有不同。主要表現(xiàn)為:用2.5 g·L－1TTC染液染色偏淺;而用10.0 g·L－1TTC染色后載玻片上有少數(shù)紅色斑點(diǎn)，即有多余染料沉積;用5.0 g·L－1TTC染色效果最好，顏色適中，且無紅色斑點(diǎn)。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，適用于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力TTC染色檢測的最佳條件為:用pH 7.0的5.0 g·L－1TTC于35℃下染色2.0 h。

2.1.2 離體培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.2.1 培養(yǎng)基中蔗糖添加量的選擇在蔗糖添加量不同的培養(yǎng)基中曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉萌發(fā)效果見表2?！瓾icksii’花粉萌發(fā)對蔗糖濃度有嚴(yán)格要求。在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，花粉活力達(dá)到65.34%。在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，花粉活力可達(dá)到78.56%;培養(yǎng)2～5 d，花粉活力均極顯著高于其他培養(yǎng)基，說明含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖的培養(yǎng)基更有利于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉管的萌發(fā)。然而，在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)20%和25%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～5 d，‘Hicksii’的花粉均沒有萌發(fā)，并出現(xiàn)不同程度的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，尤其是在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)25%蔗糖的培養(yǎng)基上幾乎所有具水合層的花粉都出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，表明培養(yǎng)基中蔗糖添加量較高對‘Hicksii’花粉萌發(fā)有明顯的抑制作用。

2.1.2.2 培養(yǎng)基中H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度的選擇在H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度不同的培養(yǎng)基中曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉萌發(fā)效果見表3。僅含200 mg·L－1H3BO3的培養(yǎng)基對‘Hicksii’花粉萌發(fā)的促進(jìn)效果略優(yōu)于僅含100 mg·L－1H3BO3的培養(yǎng)基，但添加Ca(NO3)2后，在含200 mg·L－1H3BO3－200 mg·L－1Ca(NO3)2或100 mg·L－1H3BO3－200 mg·L－1Ca(NO3)2的培養(yǎng)基上花粉活力顯著提高，表明同時(shí)含有H3BO3和Ca(NO3)2的培養(yǎng)基對‘Hicksii’花粉管萌發(fā)的促進(jìn)作用均優(yōu)于僅含有H3BO3的培養(yǎng)基，說明H3BO3和Ca(NO3)2存在相互作用。在含有H3BO3－Ca(NO3)2組合的培養(yǎng)基上花粉活力均極顯著高于僅含有H3BO3的培養(yǎng)基，而且花粉管的萌發(fā)速率也明顯加快;但同時(shí)含有H3BO3和Ca(NO3)2的2組培養(yǎng)基間花粉活力無顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:在含有H3BO3的培養(yǎng)基中同時(shí)添加適量的Ca(NO3)2對曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉萌發(fā)有十分明顯的促進(jìn)效果。

表2 在蔗糖添加量不同的培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)1～5 d曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 2 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’in vitro cultured for 1－5 d in culture media with different additions of sucrose±SD)1)

表2 在蔗糖添加量不同的培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)1～5 d曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 2 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’in vitro cultured for 1－5 d in culture media with different additions of sucrose±SD)1)

1)同列中不同的大寫和小寫字母分別表示差異極顯著(P=0.01)或顯著(P=0.05)Different capitals and small letters in the same column indicatethe extremely significant(P=0.01)or significant(P=0.05)differences，respectively.

蔗糖質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)/% Mass-volume ratio of sucrose不同培養(yǎng)時(shí)間的花粉活力/%Pollen viability at different culture times 1 d2 d3 d4 d5 d 1010.44±2.67aA43.33±3.00bB57.45±3.61bB65.34±2.43bB67.45±1.91bB 1512.98±1.02aA53.44±3.98aA78.56±2.23aA80.34±0.23aA76.97±3.28aA 200.00±0.00bB0.00±0.00cC0.00±0.00cC0.00±0.00cC0.00±0.00cC 250.00±0.00bB0.00±0.00cC0.00±0.00cC0.00±0.00cC0.00±0.00cC

表3 在H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度不同的培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)1～5 d曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 3 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’in vitro cultured for 1－5 d in culture media with different concentrations of H3BO3and Ca(NO3)2±SD)1)

表3 在H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度不同的培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)1～5 d曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的比較±SD)1)Table 3 Comparison of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’in vitro cultured for 1－5 d in culture media with different concentrations of H3BO3and Ca(NO3)2±SD)1)

1)同列中不同的大寫和小寫字母分別表示差異極顯著(P=0.01)或顯著(P=0.05)Different capitals and small letters in the same column indicate the extremely significant(P=0.01)or significant(P=0.05)differences，respectively.

質(zhì)量濃度/mg·L－1Concentration H3BO3Ca(NO3)2不同培養(yǎng)時(shí)間的花粉活力/%Pollen viability at different culture times 1 d2 d3 d4 d5 d 10005.56±1.32cB14.85±3.75cC34.45±3.58cB 37.40±4.35dD45.40±3.55dC 20004.56±1.35cB12.00±1.11cC36.87±3.37cB46.56±2.09cC54.45±4.77cB 10020012.98±1.02bA53.44±3.98aA78.56±2.23aA80.34±0.23aA76.97±3.28aA 20020016.56±2.78aA44.91±3.32bB70.22±3.00bA71.04±1.94bB70.98±3.76bA

2.1.2.3 培養(yǎng)溫度的選擇在培養(yǎng)溫度不同的條件下，曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力沒有明顯的差別，均可達(dá)到80%左右，但是所需的培養(yǎng)時(shí)間卻有很大差別。在25℃、30℃和35℃溫度條件下花粉活力達(dá)到40%所需的培養(yǎng)時(shí)間分別為3.5、2.0和1.5 d;而花粉活力達(dá)到80%所需的培養(yǎng)時(shí)間分別為6.0、4.0和3.0 d。比較而言，在35℃條件下曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉的萌發(fā)效果最好。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，適宜于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力離體培養(yǎng)檢測的最佳條件為:用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖、100 mg·L－1H3BO3和200 mg·L－1Ca(NO3)2的培養(yǎng)基，于35℃下培養(yǎng)4 d。

2.2 花粉適宜儲(chǔ)藏溫度分析

在25℃、4℃、0℃和－20℃條件下儲(chǔ)藏1～13周曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的變化見表4。在室溫(25℃)和－20℃條件下，儲(chǔ)藏7周的‘Hicksii’花粉仍有一定的活力，但在室溫(25℃)和－20℃條件下分別儲(chǔ)藏9周和10周后花粉均無活力;在4℃條件下儲(chǔ)藏10周的花粉仍具有一定的活力，但儲(chǔ)藏11周后花粉均無活力;在0℃條件下儲(chǔ)藏效果最好，儲(chǔ)藏11周的花粉仍具有一定的活力，且儲(chǔ)藏13周的花粉仍可以檢測到花粉活力。在－20℃條件下儲(chǔ)藏2周花粉活力迅速下降，說明‘Hicksii’的花粉不抗低溫。另外，本研究還對－80℃和－196℃條件下‘Hicksii’花粉活力進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示:在－80℃和－196℃條件下保存3 d曼地亞紅豆杉‘Hicksii’的花粉就失去了全部活力，說明超低溫儲(chǔ)藏方法并不適用于‘Hicksii’花粉的儲(chǔ)藏。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見:適宜于曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉儲(chǔ)藏的最適溫度為0℃。

由表4還可見:采用TTC染色法和離體培養(yǎng)法測得的花粉活力的變化趨勢基本相似，二者可以相互印證;但采用TTC染色法獲得的檢測結(jié)果均高于離體培養(yǎng)法。

表4 在不同溫度條件下儲(chǔ)藏13周的曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的變化±SD)Table 4 Change of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’stored at different storage temperatures for 13 weeks(±SD)

表4 在不同溫度條件下儲(chǔ)藏13周的曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的變化±SD)Table 4 Change of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’stored at different storage temperatures for 13 weeks(±SD)

1)采用TTC染色法的檢測結(jié)果Determination result by TTC staining method.2)采用離體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果Determination result byin vitroculture method.

時(shí)間/week Time在不同儲(chǔ)藏溫度下的花粉活力/%1)Pollen viability at different storage temperatures1)在不同儲(chǔ)藏溫度下的花粉活力/%2)Pollen viability at different storage temperatures2)25℃4℃0℃－20℃25℃4℃0℃－20℃192.30±2.4292.30±2.4292.30±2.4292.30±2.4278.56±2.2378.56±2.2378.56±2.2378.56±2.23 264.31±4.3476.25±2.0982.75±2.8119.17±2.1155.97±3.2460.00±3.2372.19±2.4415.96±0.71 345.49±3.1059.66±5.8769.44±0.9814.29±2.1838.07±1.1153.95±2.2363.87±2.8910.17±2.57 429.96±0.9841.05±2.2269.85±1.0913.73±1.9823.07±2.5632.33±3.3456.94±3.469.01±1.87 515.04±2.1136.66±1.2865.42±3.0012.41±0.8912.61±3.2124.03±2.1950.96±4.018.63±0.45 67.15±1.4529.01±3.1760.65±3.789.79±2.854.52±0.1217.05±1.0950.09±3.006.36±2.12 74.87±1.2316.03±2.9950.28±2.547.01±1.042.42±0.459.87±0.8743.01±2.595.36±0.09 82.01±0.996.44±0.4735.94±3.263.94±0.780.00±0.003.34±0.7825.03±0.990.00±0.00 90.00±0.004.28±0.9325.94±2.202.79±0.410.00±0.001.55±0.4520.79±3.460.00±0.00 100.00±0.003.45±1.3411.94±1.090.00±0.000.00±0.001.71±0.3411.94±2.430.00±0.00 110.00±0.001.51±0.238.89±3.110.00±0.000.00±0.000.00±0.003.40±1.460.00±0.00 120.00±0.000.00±0.005.00±0.790.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00 130.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00

3 討論和結(jié)論

采用TTC法測得的花粉活力高于離體培養(yǎng)法，但二者檢測結(jié)果的變化趨勢相同，可以相互印證。相比較而言，TTC染色法更方便快捷。由于部分能顯色的花粉并不一定能萌發(fā)，因而，采用TTC染色法獲得的檢測結(jié)果高于離體培養(yǎng)法。離體培養(yǎng)法以花粉管萌發(fā)作為判別花粉活力的指標(biāo)，因而其結(jié)果更準(zhǔn)確。

研究結(jié)果表明:染液pH對TTC染色法的檢測結(jié)果有極顯著影響，pH 7.0的TTC染液的染色效果極顯著優(yōu)于pH 6.0和pH 6.5的TTC染液。TTC染色法主要原理是花粉萌發(fā)過程中由脫氫酶引起的氧化還原反應(yīng)使生物染料產(chǎn)生顏色反應(yīng)，有活力花粉被染成紅色、無活力花粉不顯色。在TTC染液染色過程中，最適反應(yīng)條件可提高脫氫酶的活性、促進(jìn)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。由于酶促反應(yīng)對pH有嚴(yán)格要求，所以TTC染色法對染液pH的要求也比較高。

研究結(jié)果表明:培養(yǎng)基中的蔗糖濃度是離體培養(yǎng)法的重要影響因子。蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑可為花粉細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)臐B透壓，滲透壓過低會(huì)導(dǎo)致花粉粒非正常吸水，過高則導(dǎo)致細(xì)胞失水，推測本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的質(zhì)壁分離現(xiàn)象與此有關(guān)。添加劑對曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉的萌發(fā)率也有明顯影響，在含H3BO3的培養(yǎng)基中添加適量的Ca(NO3)2可以大幅度提高‘Hicksii’花粉的萌發(fā)率;表明H3BO3和Ca(NO3)2對‘Hicksii’花粉的萌發(fā)具有協(xié)同促進(jìn)作用。Cheng等［11］認(rèn)為:在花粉培養(yǎng)過程中硼有促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長的作用;而趙彩平等［12］和賈文慶等［13］認(rèn)為:鈣對花粉萌發(fā)也有促進(jìn)作用，能引導(dǎo)花粉管生長方向、促進(jìn)胞吐作用，從而促進(jìn)花粉管伸長。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了鈣和硼的這一促進(jìn)作用。

近年來，超低溫儲(chǔ)藏技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，主要是采用－80℃和－196℃對花粉進(jìn)行儲(chǔ)藏，具有保存效果好、保存時(shí)間長的特點(diǎn)［10，14］。然而，本實(shí)驗(yàn)中－80℃和－196℃儲(chǔ)藏3 d的花粉全部失去活力，推測可能原因有2個(gè):一是在進(jìn)行超低溫儲(chǔ)藏前沒有對‘Hicksii’花粉進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理;二是‘Hicksii’花粉對低溫的抗性較差，不適合超低溫儲(chǔ)藏。大多數(shù)適合超低溫儲(chǔ)藏的花粉在－20℃下花粉活力下降比較緩慢［15－16］，而‘Hicksii’花粉活力在－20℃下急速下降，因此，‘Hicksii’花粉耐低溫能力較差可能是主要因素，這一判斷還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

結(jié)合時(shí)間和成本等因素綜合考慮后認(rèn)為:采用TTC染色法檢測曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力的最適條件為:用pH 7.0的5.0 g·L－1TTC染液在35℃條件下染色2.0 h。采用離體培養(yǎng)法觀察花粉活力的最適條件為:花粉在含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)15%蔗糖、100 mg·L－1H3BO3和200 mg·L－1Ca(NO3)2的培養(yǎng)基上于35℃條件下培養(yǎng)4 d。而曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉的最適儲(chǔ)藏溫度為0℃。

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(責(zé)任編輯:佟金鳳)

Detection condition optimization of pollen viability of Taxus media‘Hicksii’and analysis on its suitable storage temperature

WANG Cheng-wei1，ZHENG Yu-hong1，LI Ying1，LU Bo1，PENG Feng1，①，CHEN Xiao-xuan2(1.Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China;2.Jiangsu Daqian Ecology and Landscape Co.，Ltd.，Nanjing 210024，China)，J.Plant Resour.＆Environ.2012，21(2):13－18

By single-factor experiment design，experimental conditions of TTC staining andin vitroculture methods suitable for pollen viability detection ofTaxus media‘Hicksii’were selected，and changes of‘Hicksii’pollen viability stored at conditions from 25℃to－196℃for thirteen weeks were detected by optimal conditions.The results show that the detection result of pollen viability by TTC staining method is higher than that byin vitroculture method.Among three influence factors(staining solution pH，TTC concentration and staining temperature)of TTC staining method，staining solution pH has an extremely significant influence on detection result，while staining temperature and TTC concentration have no significant influence but the former has an effect on staining speed.Among three influence factors(sucrose addition，concentrations of H3BO3and Ca(NO3)2in medium and culture temperature)ofin vitroculture method，sucrose addition has an extremely significant influence on detection result.The pollen viability is the highest in medium containing 15%(mass-volume ratio) sucrose，while all of pollens can not germinate in media containing 20%or25%(mass-volume ratio)sucrose.Addition of 200 mg·L－1Ca(NO3)2in media containing 100 or 200 mg·L－1H3BO3can obviously improve pollen viability，and culture temperature has an effect on pollen germination speed but no obvious effect on pollen viability.The optimal detection condition of TTC staining method is taking 5.0 g·L－1TTC solution(pH 7.0)，dyeing at 35℃for 2.0 h.The optimal detection condition ofin vitroculture method is using culture medium containing 15%(mass-volume ratio)sucrose，100 mg·L－1H3BO3and 200 mg·L－1Ca(NO3)2，taking dark culture for 4 d.Stored at 25℃，4℃，0℃，－20℃，－80℃and－196℃for thirteen weeks，pollen viability of‘Hicksii’and its retain time have significant differences.In which，pollens lost viability stored at－80℃or－196℃for 3 d，pollens still have a certain viability stored at 25℃or－20℃for seven weeks and at 4℃for ten weeks，while pollen viability is the highest stored at 0℃and pollen still has a certain viability after stored at 0℃for eleven weeks.It is conjectured that the resistance of pollen ofT.media‘Hicksii’to low temperature is weak，and its suitable storage temperature is 0℃.

Taxus media‘Hicksii’;pollen viability;TTC staining method;in vitroculture method; storage temperature

book=2012,ebook=1

Q944.42;S791.49.04

A

1674－7895(2012)02－0013－06

2011－11－19

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2010417);中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(KSCX2－YW－Z－0921)

王呈偉(1986—)，男，山東德州人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橛^賞植物生物技術(shù)及觀賞植物遺傳育種等。

①通信作者E-mail:pfeng@vip.sina.com