周鳴謙，劉云鶴，2，陳宏柱

（1.淮海工學院海洋學院，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222005）

β－胡蘿卜素能降低生物體內因自由基誘發(fā)的過氧化作用，具有延緩衰老和防止癌變的功能；同時它還是VA的前體，可用做化妝品助劑、食品和飼料添加劑等。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）具有較強的β－胡蘿卜素合成能力，在適宜條件下培養(yǎng)，其β－胡蘿卜素積累量最高可達藻體干重的14%[1]，是較具開發(fā)潛力的β－胡蘿卜素天然資源。β－胡蘿卜素的提取以溶劑法為主，用超聲波、微波和超臨界流體等手段輔助提取以提高得率[2－7]。本文主要對超聲波強化提取杜氏鹽藻中β－胡蘿卜素的方法進行研究，為杜氏鹽藻的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

杜氏鹽藻粉：購于山東富施特生物技術有限公司，經(jīng)超臨界二氧化碳脫脂處理。

1.1.2 試劑

丙酮、甲醇、石油醚（沸程60℃～90℃）、氯仿，以上試劑均為分析純；β－胡蘿卜素標準品，純度≥90%。

1.1.3 儀器

SK8210LHC超聲波儀：國華電器有限公司；UV745N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有

式中：X為β-胡蘿卜素的得率，%；C為在標準曲線上查得的β-胡蘿卜素的含量，（μg/mL）；V1為層析時點樣體積，mL；V2為從濃縮液中取出0.1 mL后定容的體積，mL；m 為樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 液料比的影響

根據(jù)參考文獻[2，4]設定 4 個液料比（mL∶g）梯度（2∶1、4∶1、6 ∶1、8∶1），用超聲波（功率 300 W）強化90 s后在溫度為25℃條件下提取4次，每次提取5 min，合并提取液后測定β-胡蘿卜素的含量并計算其得率。

1.2.3.2 超聲強化時間的影響

在提取溫度為25℃、提取時間為5 min、液料比為 6∶1（mL∶g）的條件下，用超聲波（功率 300 W）分別強化30、60、90、120 s，提取4次，合并提取液后測定β-胡蘿卜素的含量并計算其得率。

1.2.3.3 提取溫度的影響

在液料比為 6∶1（mL∶g），超聲波（功率 300 W）強化時間60 s條件下，分別在15、25、35、45℃提取鹽藻中β-胡蘿卜素5 min，提取4次，合并提取液后測定β-胡蘿卜素的含量并計算其得率。

1.2.3.4 提取時間的影響

在液料比6∶1（mL∶g），超聲波（功率 300 W）強化時間 60 s，溫度 25℃條件下分別提取 3、5、7、9 min，提取4次，合并提取液后測定β-胡蘿卜素的含量并計算其得率。限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵:鞏義市英峪予華儀器廠；GF254 200 mm×100 mm薄層層析硅膠板:安徽良臣硅源材料有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽藻中β-胡蘿卜素的提取流程

脫脂后的藻粉→稱取適量置于棕色試劑瓶中→加丙酮∶甲醇（7∶2）[3，8]→超聲波輔助提取→恒溫靜置→得第1次浸提液→沉淀加入提取劑再重復提取3次→合并4次提取液→離心20 min，得提取液。

1.2.2 β-胡蘿卜素含量的測定

將β-胡蘿卜素提取液轉移至蒸發(fā)皿進行真空干燥，然后用丙酮沿壁將色素洗下收集定容至5 mL，得濃縮液。按照GB12291-1990《水果、蔬菜汁類胡蘿卜素含量的測定》[9]的方法測定濃縮液β-胡蘿卜素的含量。經(jīng)測定，β-胡蘿卜素標準工作曲線為y=0.071 3x，R2=0.973。β-胡蘿卜素的得率按照以下方法計算：

1.2.4 正交試驗

采用四因素三水平正交試驗設計研究液料比（A）、超聲波強化時間（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）共同作用下對β-胡蘿卜素提取率的影響，優(yōu)化提取工藝條件，因素水平如表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比的影響

液料比的影響結果見圖1。

圖1 液料比對β-胡蘿卜素得率的影響Fig.1 Effects of organic solvent quantity on the extraction of β-Carotene

由圖1知，隨著液料比的增加，β-胡蘿卜素的溶出量也隨之增加。液料比從 2∶1（mL∶g）增加至 6∶1（mL∶g），β-胡蘿卜素的溶出量有明顯增加；而液料比從6∶1（mL∶g）增加至 8∶1（mL∶g），β-胡蘿卜素的溶出量增加不明顯。這是由于在一定的提取條件下，提取劑體積增加，能溶出的β-胡蘿卜素的量也增加，但是當提取劑增加至一定限度時，易溶解的β-胡蘿卜素都已溶出，增加就不明顯了。

2.1.2 超聲強化時間的影響

超聲強化時間的影響結果見圖2。

圖2 超聲波強化時間的影響Fig.2 Effects of ultrasound-assisted time on the extraction of β-Carotene

超聲波在液體中有分散效應，使液體產(chǎn)生空化作用，從而使液體中的鹽藻細胞破碎，促使β－胡蘿卜素的溶出。由圖2知，超聲強化時間為30、60、90 s的組別比未經(jīng)強化組別高，其中強化60 s的組別效果最好。而當強化時間增至120 s時，由于超聲波的熱效應而致使提取液的溫度升高，破壞了部分β－胡蘿卜素，因此β－蘿卜素的得率不但沒有增加，反而減少。

2.1.3 提取溫度的影響

提取溫度的影響結果見圖3。圖3 提取溫度的影響

Fig.3 Effects of temperature on the extraction of β-Carotene

β－胡蘿卜素化學性質不穩(wěn)定，加熱時易被氧化。從圖3可看出，溫度從15℃升至25℃時，提取出的β－胡蘿卜素的量明顯增加。超過25℃時，部分β－胡蘿卜素被破壞，提取量明顯減少。

2.1.4 提取時間的影響

提取時間的影響結果見圖4。

圖4 提取時間的影響

Fig.4 Effects of time on the extraction of β-Carotene

從圖4可知，β－胡蘿卜素的溶出量隨著提取時間的延長而增加，3 min至7 min增加明顯，但再繼續(xù)延長提取時間，β－胡蘿卜素的溶出量增加緩慢。

2.2 正交試驗

正交試驗安排及結果見表2。

通過極差R分析可知，四因素對鹽藻中β－胡蘿卜素提取量的影響程度依次為超聲強化時間＞提取時間＞提取溫度＞液料比。即在所設水平條件下，超聲強化時間對β－胡蘿卜素的提取率的影響最為明顯，提取時間、提取溫度和液料比在一定范圍內對β－胡蘿卜素的提取量也有一定的影響，其中液料比影響最小。通過對各因素不同水平K值的比較，得出各個因素的最佳組合為 A1B3C1D3，即液料比 6∶1（mL∶g），超聲波強化時間70 s，提取溫度20℃，提取時間為9 min。

表2 正交試驗安排及試驗結果Table 2 Arrangement and results in orthogonally designed test

由于A1B3C1D3組合在試驗處理中未出現(xiàn)，故進行驗證試驗，此條件下β－胡蘿卜素的得率為4.418%，高于正交試驗各處理的β－胡蘿卜素得率，此組合即為提取工藝的最優(yōu)條件。

3 結論

超聲強化提取鹽藻中β－胡蘿卜素受到液料比、超聲波強化時間、提取溫度和提取時間等因素的影響，在正交試驗所設定因素水平下其影響程度依次為超聲波強化時間＞提取時間＞提取溫度＞液料比，其最優(yōu)提取工藝條件為，液料比6∶1，超聲波強化時間70 s，提取溫度20℃，提取時間為9 min，其條件下β－胡蘿卜素得率可達4.418%。

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