張平，高迪，杜鵑，楊敬研，崔柏青

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院軍事體育教學(xué)部，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)，吉林吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林吉林 132013）

林蛙油是一種營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值極高的藥食兩用食物，含有多種營(yíng)養(yǎng)成分及保健功能因子[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，林蛙油具有調(diào)節(jié)血脂、耐缺氧作用、耐寒和抗疲勞作用[2-6]。長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體肝臟組織自由基增多，對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，影響運(yùn)動(dòng)能力[7]。林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中抗自由基氧化功能的影響研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)觀察林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟組織自由基代謝和超微結(jié)構(gòu)的影響，為林蛙油進(jìn)一步的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 林蛙油

吉林市市售，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。按成?0 kg體重計(jì)，按日攝入量6 g的1倍、5倍和10倍設(shè)計(jì)。加水將林蛙油泡發(fā)12 h后，蓋上保鮮膜放入鍋內(nèi)蒸15 min，冷卻，勻漿，制成所需濃度，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠，20 g～22 g，65只。由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要儀器

TD-5A離心機(jī)：湖南凱達(dá)湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；JD－XSC小鼠恒溫游泳池：上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠；722分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；透射電子顯微鏡：日本JEM－1200EX；LKB超薄切片機(jī)：日本；九陽(yáng)料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司。

1.1.4 主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測(cè)試盒：南京建成生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠按體重隨機(jī)分為5組，為安靜組、運(yùn)動(dòng)組、林蛙油低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組13只小鼠，其中安靜組和運(yùn)動(dòng)組灌胃蒸餾水，林蛙油各組給予對(duì)應(yīng)的林蛙油勻漿液灌胃，每組灌胃劑量為0.4 mL。每周稱重1次，調(diào)節(jié)林蛙油灌胃劑量。

1.2.2 小鼠運(yùn)動(dòng)模型的建立

運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行4周的游泳訓(xùn)練，水深不低于40 cm，水溫（25±1）℃，每周訓(xùn)練6 d，休息 1 d，每次灌胃 30 min后進(jìn)行游泳訓(xùn)練。第1周每天游泳30 min，以后每周運(yùn)動(dòng)時(shí)間遞增15 min。第4周后最后1 d灌胃30 min后，各組進(jìn)行無(wú)負(fù)重力竭性游泳，記錄游泳時(shí)間。游泳至力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為：小鼠沉入水中8 s不能自主浮上水面，且放在平面上無(wú)法完成翻正反射，記錄小鼠自游泳開始至沉入水中8 s不能浮起時(shí)間。

1.2.3 超氧化物歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）含量測(cè)定

于第4周最后1 d，各組力竭運(yùn)動(dòng)后，眼球取血，斷頭處死，取肝臟組織，4℃預(yù)冷，生理鹽水洗凈，用濾紙吸去肝臟組織表面水分，制成100g/L的勻漿液，3500 r/min，離心10 min，取上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化酶活性（SOD）、丙二醛（MDA）含量測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測(cè)試方法嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 透射電鏡標(biāo)本制備

各組隨機(jī)取小鼠3只，烏拉坦麻醉，固定在解剖臺(tái)上，開腹暴露肝臟，取肝臟右葉，將其切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，放在2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%鋨酸后固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，LKM超超薄切片機(jī)切片，透射電子顯微鏡JEM－1200EX進(jìn)行觀察照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組間差異采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠游泳至力竭時(shí)間的影響

不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠游泳至力竭時(shí)間的影響，見表1。

表1 不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠游泳至力竭時(shí)間的影響（±s）n=10Table 1 Effect on exhaustive swimming time of athletic training mice with different dosages of oviductus ranae

表1 不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠游泳至力竭時(shí)間的影響（±s）n=10Table 1 Effect on exhaustive swimming time of athletic training mice with different dosages of oviductus ranae

注：*p＜0.05，**p＜0.01。

組別 力竭時(shí)間/min對(duì)照組 95.90±8.41運(yùn)動(dòng)組 111.00±10.36低劑量組 111.40±7.24中劑量組 286.80±59.01**高劑量組 243.50±48.65**

由表1可知，游泳訓(xùn)練能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭性游泳時(shí)間。游泳訓(xùn)練的同時(shí)補(bǔ)充林蛙油，可使力竭性游泳時(shí)間進(jìn)一步顯著延長(zhǎng)。林蛙油各劑量組小鼠游泳時(shí)間中劑量組最高，各劑量組與訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)組比較，中、高劑量組有顯著差異（p＜0.01）。

2.2 不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響

不同劑量林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響，見表2。

表2 林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（±s）n=10Table 2 Effect on SOD activity and MDA amount in liver of athletic training mice with different dosages of oviductus ranae

表2 林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（±s）n=10Table 2 Effect on SOD activity and MDA amount in liver of athletic training mice with different dosages of oviductus ranae

注：*p＜0.05，**p＜0.01。

組別SOD/（U/mgrpot）MDA/（nmoL/mgrpot）對(duì)照組 11.48±0.86 3.86±1.00運(yùn)動(dòng)組 9.26±0.97** 3.91±0.78低劑量組 10.22±0.86* 3.50±0.58中劑量組 11.13±0.42** 3.37±0.53高劑量組 10.80±77** 3.35±0.44

表2顯示，運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組比較，SOD活性顯著降低，有顯著差異（p＜0.01）。運(yùn)動(dòng)組與林蛙油各劑量組比較，SOD活性顯著降低，其中低劑量組（p＜0.05），中、高劑量組（p＜0.01）。MDA的含量運(yùn)動(dòng)組最高，林蛙油各劑量組有下降趨勢(shì)，與運(yùn)動(dòng)組相比，無(wú)顯著異。

2.3 林蛙油對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組肝細(xì)胞核呈圓形，核膜完整，核內(nèi)常染色質(zhì)多，胞質(zhì)內(nèi)可見較豐富排列整齊的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和結(jié)構(gòu)完整的線粒體，糖原顆粒分布均勻（見圖1～圖2）。游泳組核仁可見，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，輕度擴(kuò)張，線粒體減少呈致密狀，胞質(zhì)基質(zhì)高度空化，細(xì)胞器局

3 討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是由運(yùn)動(dòng)而引起的運(yùn)動(dòng)能力和身體功能暫時(shí)下降現(xiàn)象。力竭是指肌肉或器官完全不可能維持運(yùn)動(dòng)的特殊疲勞現(xiàn)象。隨著對(duì)自由基研究的深入，自由基生成的增加是導(dǎo)致疲勞的重要因素之一。在正常生理情況下，機(jī)體保持低水平自由基，劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)使自由基生成量增多，是誘發(fā)疲勞的原因之一[7－8]。力竭運(yùn)動(dòng)作為一種生理應(yīng)激，使機(jī)體肝臟產(chǎn)生的自由基增多已被許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9－12]，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物之一，其含量能間接反映機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD能有部消失，糖原顆粒減少（見圖3～圖4）。林蛙油組與運(yùn)動(dòng)組有相同情況的變化，但損傷程度明顯較運(yùn)動(dòng)組輕（見圖 5～圖 6）。效清除自由基，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，保持機(jī)體細(xì)胞免受運(yùn)動(dòng)性損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠補(bǔ)充林蛙油后，SOD活性增加，MDA的含量下降，有明顯的抗自由基氧化的功能，可阻止細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，提高小鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。

許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)急性力竭或劇烈運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自由基對(duì)肝臟造成損傷。表現(xiàn)為線粒體腫脹，空泡化，膜與嵴溶解，有基質(zhì)電子密度不均勻現(xiàn)象；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、減少、變形、扭曲，規(guī)則分布消失；糖原分布減少；細(xì)胞核出現(xiàn)不規(guī)則的變化，電子密度明顯變異[9－12]。本研究結(jié)果表明，小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后，也有相似的結(jié)構(gòu)變化，補(bǔ)充林蛙油可使肝細(xì)胞損傷減輕。這可能是林蛙油能提高肝臟細(xì)胞SOD活性和降低MDA含量，有利于自由基的清除。表明林蛙油具有保護(hù)肝臟細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)機(jī)體防御體系的功能，進(jìn)而防止運(yùn)動(dòng)性損傷及提高運(yùn)動(dòng)能力，也為林蛙油的深度開發(fā)提供參考。

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