文 勇 Yongil KWON 于 順

(1.南首爾大學(xué)公共衛(wèi)生管理部，天安331-707;2.翰林大學(xué)江東圣心醫(yī)院婦產(chǎn)科，首爾150-030;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053)

長期飲酒可以造成多種器官損害，包括肝臟［1］、胰腺［2］和大腦［3-4］。體外研究［5-7］也證明，乙醇可以引起多種細(xì)胞凋亡。然而，乙醇引起細(xì)胞凋亡的早期信號傳導(dǎo)機(jī)制卻不甚清楚。絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在指導(dǎo)細(xì)胞對各種刺激產(chǎn)生反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動，如增生、分化和凋亡［8］。MAPK信號通路包括3個重要通路［8-9］:①細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，即ERK通路;② c-jun N-末端激酶，JNK通路;③ p38 MAPK(p38K)通路。ERK1和ERK2是增生信號的主要傳感器，主要被絲裂原活化。而JNK和p38K則主要被引起細(xì)胞應(yīng)激的各種刺激激活。研究［8-9］表明，JNK和p38K可以介導(dǎo)損害性刺激引起的細(xì)胞凋亡。然而，它們在乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的潛在作用還未見報(bào)道。

本研究將利用培養(yǎng)SK-N-SH成神經(jīng)瘤細(xì)胞研究JNK和p38K通路在乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SK-N-SH細(xì)胞(American type culture collection，USA);DMEM培養(yǎng)基(fisher bioblock scientific，F(xiàn)rance);MTS溶液(Promega，USA);抗JNK和磷酸化JNK以及抗p38K和磷酸化p38K抗體(Santa Cruz，USA);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG(Vector Laboratories，USA);ECL 顯色 液(Promega，USA);caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC(BD Pharmingen，USA);胎牛血清(Gibco，USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-N-SH細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱充以5%CO2和95%空氣。

1.3 細(xì)胞死亡率測定

向乙醇處理后細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20 μL MTS(5 g/L)溶液，孵育4 h，于490 nm波長處檢測各孔的光吸收值。細(xì)胞死亡率=對照細(xì)胞吸收值-乙醇處理細(xì)胞吸收值/對照細(xì)胞吸收值×100%。

1.4 DAPI染色

細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，用PBS洗去固定液，然后加DAPI溶液(0.5 ng/L)染色3～5 min。封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞核。

1.5 DNA片段分析

DNA片段分析采用半定量連接反應(yīng)介導(dǎo)的DNA平端方法進(jìn)行［10］。

1.6 Caspase-3活性測定

制備全細(xì)胞勻漿，將細(xì)胞勻漿(50 ng/L)與caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC反應(yīng)。用熒光讀板機(jī)于360 nm激發(fā)光和450 nm發(fā)射光處測定熒光值。

1.7 免疫印跡分析

全細(xì)胞提取物或胞質(zhì)組分 (50～100 μg)用PAGE分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜，然后分別與針對不同蛋白的 1抗體(phospho-JNK，JNK，phospho-p38 kinase，and p38 kinase protein)及相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(1∶5 000)孵育。辣根過氧化物酶活性用ECL試劑盒檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析方法和均數(shù)多重比較方法，2組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙醇對細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響

如圖1A所示，未經(jīng)乙醇處理的對照SK-N-SH細(xì)胞在顯微鏡下有較高的密度，細(xì)胞呈梭型。乙醇(100 mmol/L)處理24 h的細(xì)胞在顯微鏡下密度較低，呈梭型的活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，很多細(xì)胞收縮呈圓形，體積較小。MTS法測試結(jié)果表明，乙醇可以增加死亡細(xì)胞的數(shù)量，并且隨著乙醇劑量的增加，死亡細(xì)胞的數(shù)量也隨之增加，尤其是當(dāng)乙醇的濃度由50 mmol/L增加到100 mmol/L時，細(xì)胞死亡的百分率增加顯著(圖1B)。

圖1 乙醇對細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響Fig.1 Effect of ethanol on cell morphology and viability

2.2 乙醇引起細(xì)胞凋亡樣改變

用100 mmol/L乙醇處理細(xì)胞后 12 h，引起caspase 3增高，并在所觀察的24 h內(nèi)一直保持高水平(圖2A)。DNA片段分析表明，乙醇(100 mmol/L)處理24 h后，細(xì)胞核DNA出現(xiàn)斷裂的梯度樣改變，隨著時間進(jìn)一步延長而愈加明顯(圖2B)。DAPI細(xì)胞核染色顯示，乙醇處理24 h的細(xì)胞，許多細(xì)胞的核呈碎裂現(xiàn)象(圖2C)。

2.3 乙醇引起JNK和p38K磷酸化

乙醇可以引起46 000和54 000磷酸化JNK表達(dá)增加，這一變化最早發(fā)生于乙醇處理后的1 h，并在4～16 h達(dá)到較高水平，此后有所回落。乙醇也引起磷酸化p38K表達(dá)增加，其最早變化也發(fā)生于乙醇處理后的1 h，并在4 h后達(dá)到高峰，隨后開始回落，詳見圖3。

2.4 JNK和p38K磷酸化抑制劑減輕乙醇引起的細(xì)胞死亡

乙醇引起的磷酸化JNK和p38K增高伴隨細(xì)胞死亡率的增加，而用磷酸化抑制劑 SP600125和SB203580分別抑制JNK和p38K的磷酸化后，則細(xì)胞的死亡率明顯降低(圖4)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，乙醇可以引起SK-N-SH成神經(jīng)細(xì)胞死亡，并表現(xiàn)為凋亡樣改變，包括caspase-3激活，細(xì)胞核碎裂以及DNA斷裂。這些結(jié)果提示，乙醇引起的細(xì)胞死亡形式主要是細(xì)胞凋亡。乙醇介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路尚不十分清楚。JNK和p38K通路均屬于MAPK家族的成員，主要介導(dǎo)損害性刺激引起的細(xì)胞凋亡［8-9］。其中，JNK是細(xì)胞增生和凋亡不可或缺的。JNK激活是引起細(xì)胞增生還是凋亡取決于刺激的強(qiáng)度和激活的細(xì)胞類型。一般認(rèn)為，瞬間的JNK激活促進(jìn)細(xì)胞的生存，而持續(xù)性的JNK激活引起細(xì)胞凋亡［11］。另有研究［12］表明，p38K 激活對凋亡的影響也具有兩面性，其激活是促進(jìn)細(xì)胞凋亡還是抑制凋亡取決于刺激的強(qiáng)度和細(xì)胞的類型。我們觀察了乙醇處理細(xì)胞JNK和p38K的活化及其與乙醇引起的細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，乙醇處理細(xì)胞的磷酸化JNK和p38K表達(dá)增加，提示JNK和p38K通路被激活。然而，JNK的激活持續(xù)時間較長，而p38K的激活時間比較短暫。這一結(jié)果提示，JNK通路在乙醇引起的SK-N-SH成神經(jīng)細(xì)胞的死亡中起主要作用。我們利用JNK和p38K磷酸化抑制劑SP600125和SB203580分別抑制JNK和p38K磷酸化后，乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡明顯受到抑制，進(jìn)一步說明JNK和p38K通路在乙醇誘導(dǎo)的SK-N-SH成神經(jīng)細(xì)胞的死亡中的作用。

本研究并不排除其他機(jī)制在乙醇引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用。例如，氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和硫胺素缺乏等因素［13-14］。然而，本研究結(jié)果提示，乙醇引起的神經(jīng)細(xì)胞退變的部分原因很可能與其直接激活JNK和p38K通路從而引起細(xì)胞損傷有關(guān)。

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