盛 瑾 劉文嫻 李 鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科監(jiān)護(hù)室，北京100029)

1997年，Asahara等［1］從人外周血中分離得到一類具有內(nèi)皮細(xì)胞及祖細(xì)胞特性的細(xì)胞，將其命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。隨后發(fā)現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記和增生能力的不同，EPCs分為早期 EPCs和晚期 EPCs［2］。大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)［3］表明，EPCs是維持內(nèi)皮完整性和血管自身平衡的重要部分。晚期EPC較早期EPCs形成管腔能力和增生能力更強(qiáng)，可最終生成血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生，修復(fù)受損內(nèi)皮的功能可以更好的促進(jìn)心肌梗死后心肌的修復(fù)。作為新一代的他汀藥，瑞舒伐他汀已經(jīng)被證實(shí)擁有更強(qiáng)的降脂及穩(wěn)定、部分逆轉(zhuǎn)粥樣斑塊和改善血管內(nèi)皮功能的治療價(jià)值［4］，但其是否對(duì)晚期EPCs的功能具有改善作用，國內(nèi)外相關(guān)研究較少，因此我們進(jìn)行本項(xiàng)研究，探討不同濃度、不同作用時(shí)間瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs的增生、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

1.1.1 試劑

EPC培養(yǎng)基(endothelium basis medium 2，EBM-2;美國Sigma公司)，胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)，人纖維連接蛋白(美國Sigma公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(英國Amersham Pharmacia公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的荊豆凝集素(FITC-ulex europaeus agglutinin，F(xiàn)ITC-UEA-I;美國Sigma公司)，Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acetylated low density lipoprotein，Dil-acLDL;美國Molecular Probe公司)，苯基四氮唑溴鹽(華美生物工程公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國 Sigma公司)，TUNEL試劑盒(美國 羅氏公司)，瑞舒伐他汀(阿斯利康公司)。

1.1.2 主要器材

熒光倒置顯微鏡(德國 Leica 4000B型)，熒光正置顯微鏡(日本OlympusBX-51)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司產(chǎn)品)，酶標(biāo)檢測儀(德國 Beckman公司)，超凈工作臺(tái)(北京昌平長城凈化空氣儀器廠)，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16C)。細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、培養(yǎng)皿等耗材購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象

健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，8～12周，購自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):13706。

1.2.2 晚期EPCs的培養(yǎng)和分離

將健康Wistar大鼠處死后，取下肢長骨骨髓，加到淋巴細(xì)胞分離液中，離心，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，置入EBM-2中，重懸細(xì)胞，然后接種于纖維連接蛋白預(yù)包被的6孔板中。每隔2 d換液，用PBS洗除非貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至28 d，再加PBS洗除非貼壁細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞［5］。

1.2.3 細(xì)胞染色及鑒定

在細(xì)胞培養(yǎng)第28 d，用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，洗滌，應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton-100打孔，將貼壁細(xì)胞與 Dil-acLDL(2.4 mg·L-1)孵育;將 FITCUEA-I(10.0 mg·L-1)加入標(biāo)本中，孵育1 h，最后用體積分?jǐn)?shù)50%甘油封片，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察。鏡下Dil-acLDL染色細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC-UEA-I染色細(xì)胞呈綠色，DAP染色細(xì)胞I呈藍(lán)色，3種染色均為陽性的細(xì)胞可鑒定為正在分化的晚期EPCs。

1.2.4 試驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

1)藥物配制:瑞舒伐他汀以無水乙醇溶解后，再加入與瑞舒伐他汀等摩爾的NaOH，50℃水浴2 h，調(diào)整pH值至7.20，過濾除菌，調(diào)節(jié)濃度至0.001、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L 備用。

2)試驗(yàn)分組:(1)他汀不同濃度組:①對(duì)照組:以不含瑞舒伐他汀培養(yǎng)基與EPCs共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間與實(shí)驗(yàn)組一致。②實(shí)驗(yàn)組:以含不同濃度瑞舒伐他汀的培養(yǎng)基(分別為 0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)與晚期EPCs共培養(yǎng)24 h。(2)他汀共培養(yǎng)不同時(shí)間組:①對(duì)照組:以含0.1 μmol/L瑞舒伐他汀的培養(yǎng)基與晚期EPCs共培養(yǎng)0 h。②實(shí)驗(yàn)組:以含0.1 μmol/L瑞舒伐他汀的培養(yǎng)基與晚期EPCs共培養(yǎng)不同時(shí)間 (分別為 1、3、6、12、24、48 h)。

1.2.5 晚期EPCs增生能力的檢測

將同等數(shù)目的晚期EPCs(2×103)接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的瑞舒伐他汀，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照組;繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入體積分?jǐn)?shù)5%苯基四氮唑溴鹽10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;加二甲基亞砜100 μL，室溫下脫色搖床上振蕩10 min溶解，置酶標(biāo)檢測儀測定450 nm處的吸光度(A)，比較各組間的增生功能的差異。

1.2.6 晚期EPCs遷移能力的檢測

將同等數(shù)目的晚期 EPCs(2×104)懸于100 μL培養(yǎng)液中，注入Transwell小室的上室;將含有血管內(nèi)皮生長因子(50 μg·L-1)的500 μL培養(yǎng)液加入到下室，孵育24 h后取出，刮去上層未移動(dòng)細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定10 min，Giemsa染色30 min，去離子水清洗后晾干，倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)連續(xù)高倍視野(200×)，計(jì)數(shù)遷移至底層的EPCs，比較各組間遷移功能的變化。

1.2.7 晚期EPCs凋亡能力的檢測

應(yīng)用TUNEL試劑盒進(jìn)行凋亡檢測:用4%的多聚甲醛固定1 h，PBS緩沖液漂洗，加入3%H2O2阻斷液20℃作用10 min，加穿孔液于4℃作用30 min，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，加覆蓋膜，濕盒中37℃作用1 h，加50 μL 轉(zhuǎn)換POD 溶液，加50 μL DAB 底物，避光顯色1～2 min，根據(jù)顯色情況及時(shí)用PBS漂洗后在顯微鏡下觀察。TUNEL陽性的細(xì)胞比例由在3個(gè)不同的視野數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞來確定。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料多組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期EPCs的生物學(xué)特征

培養(yǎng)2 d后大部分(70% ～80%)早期EPCs貼壁;細(xì)胞呈圓形，體積較小(圖1A);培養(yǎng)至第7～8天，細(xì)胞體積增大，透亮度增強(qiáng)，呈現(xiàn)梭形早期EPCs(圖1B);第27～28天，呈現(xiàn)鋪路石樣晚期EPCs(圖1C)。

圖1 光鏡下早期EPCs與晚期EPCs的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of early EPCs and late EPCs in optical microscope

2.2 晚期EPCs的熒光染色鑒定

晚期EPCs具有吞噬功能，可吞噬Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)以及FITC標(biāo)記的荊豆凝集素(FITC-UEA-I)。在熒光顯微鏡下，Dil-acLDL呈紅色(圖2A)，F(xiàn)ITC-UEA-I呈綠色(圖2B)，DAPI細(xì)胞核染色呈藍(lán)色(圖2C)。據(jù)此，可鑒定為正分化的晚期EPCs(圖2D)。

圖2 晚期EPCs熒光染色鑒定Fig.2 Fluorescent staining demonstrated late endothelial progenitor cells

2.3 瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs增生功能的影響

MTT法檢測晚期EPCs增生功能變化，結(jié)果顯示:與對(duì)照組(A值為0.227±0.006)相比，加入不同濃度瑞舒伐他汀(分別為 0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，均能改善 EPCs的增生活性(P＜0.05)。EPCs的增生活性在0.1 μmol/L組增加最明顯(P＜0.01)，并且0.1 μmol/L組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而當(dāng)繼續(xù)增加瑞舒伐他汀濃度時(shí)，EPCs的增生活性反呈下降趨勢(shì)，但100 μmol/L組(A值為0.274±0.010，P＜0.01)仍高于對(duì)照組(圖3A)。

0.1 μmol/L瑞舒伐他汀處理晚期EPCs持續(xù)不同時(shí)間(分別為 1、3、6、12、24、48 h)后，除 1 h 組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，細(xì)胞的增生功能隨處理時(shí)間的延長而增強(qiáng)，顯示了時(shí)間依賴性(P＜0.05)，48 h效果最強(qiáng)(A值為0.300±0.008，P＜0.01)(圖3B)。瑞舒伐他汀可顯著地改善晚期EPCs的增生功能，且呈濃度依賴性(F=64.11，P＜0.01)和時(shí)間依賴性(F=62.22，P ＜0.01)。

圖3 瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs增生功能影響Fig.3 Effects of rosuvastatin on late EPCs proliferation

2.4 瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs遷移功能的影響

采用Transwell小室檢測瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs遷移功能的影響，發(fā)現(xiàn)各濃度(分別為0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)瑞舒伐他汀共培養(yǎng) 24 h后均明顯改善EPCs的遷移功能(P＜0.05)。當(dāng)濃度為0.1 μmol/L時(shí)，瑞舒伐他汀改善作用最強(qiáng)(P＜0.01);當(dāng)隨濃度增高，改善作用無明顯提高;而當(dāng)繼續(xù)增加瑞舒伐他汀濃度時(shí)，EPCs的增生活性反呈下降趨勢(shì)，與濃度為0.1 μmol/L時(shí)相比，濃度為100.0 μmol/L的瑞舒伐他汀提高晚期EPCs的遷移功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06)(圖4A)。

當(dāng)濃度為0.1μmol/L的瑞舒伐他汀與晚期EPCs共培養(yǎng)(分別為 1、3、6、12、24、48 h)不同時(shí)間后，其明顯提高晚期 EPCs遷移功能;與對(duì)照組相比(N=22.2±3.2)，提示細(xì)胞的遷移功能隨處理時(shí)間的延長而增強(qiáng)，顯示了一定時(shí)間依賴性(P＜0.05)，24～48 h效果最佳，與對(duì)照組相比(N=22.2±3.2)，共培養(yǎng)48 h后，其遷移功能顯著提高(N=48.6±3.4，P＜0.01)(圖4B)。瑞舒伐他汀可顯著改善晚期EPCs的遷移功能，且呈濃度依賴性(F=16.83，P＜0.01)和時(shí)間依賴性(F=54.64，P ＜0.01)。

2.5 瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs凋亡功能的影響

TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡功能，結(jié)果為:當(dāng)共培養(yǎng)24 h后，瑞舒伐他汀濃度自0.001 μmol/L～100.00 μmol/L均能增強(qiáng)EPCs抗凋亡能力(P＜0.05)，隨濃度升高，瑞舒伐他汀降低凋亡功能增強(qiáng);當(dāng)濃度為0.1 μmol/L時(shí)，晚期EPCs凋亡率最低(P＜0.01);但隨濃度進(jìn)一步升高(分別為1.0、10.0、100.0×10-4μmol/L)，凋亡率無明顯降低(圖5A)。濃度為100.0 μmol/L和濃度為0.1 μmol/L的瑞舒伐他汀，對(duì)晚期EPCs凋亡功能降低程度相似(P=0.22)。當(dāng)濃度為0.1 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組(凋亡率為33.22±0.91)相比，瑞舒伐他汀隨培養(yǎng)時(shí)間延長(分別為 1、3、6、12、24、48 h)均可改善晚期EPCs的凋亡功能。當(dāng)共培養(yǎng)6 h，瑞舒伐他汀可顯著降低細(xì)胞凋亡(凋亡率為26.96±0.81，P＜0.01)，但此時(shí)較共培養(yǎng)48 h的凋亡率無明顯變化(P=0.06)。說明處理需持續(xù)一段時(shí)間才會(huì)對(duì)改善細(xì)胞凋亡有影響，隨處理時(shí)間的延長抑制凋亡的作用能得到一定程度的改善，但繼續(xù)延長時(shí)間抑制作用進(jìn)入平臺(tái)期，未得到進(jìn)一步增強(qiáng)(圖5B)。瑞舒伐他汀可顯著降低晚期EPCs的凋亡功能，且具有濃度依賴性(F=31.20，P ＜0.01)和時(shí)間依賴性(F=69.33，P ＜0.01)。

3 討論

EPCs主要存在于骨髓，也可來源于外周血、脾臟、脂肪等組織。主要功能是促進(jìn)血管新生和維持內(nèi)皮功能;與早期EPCs相比，晚期EPCs更成熟，增生能力更強(qiáng)，分泌更多一氧化氮(NO)，形成新生血管能力更強(qiáng)［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)2 d后細(xì)胞呈圓形、體積較小的單個(gè)核細(xì)胞;第7～8天時(shí)，變?yōu)樗笮蔚脑缙贓PCs，28 d時(shí)出現(xiàn)鋪路石樣的晚期EPCs;且可吞噬熒光染料FITC-UEA-I和Dil-acLDL，因此可鑒定為晚期EPCs。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、高血壓、糖尿病等患者的晚期EPCs數(shù)量減少、功能受損［6-8］，HMGCoA還原酶抑制劑(即他汀類藥)除了抑制膽固醇合成外，他汀類藥物還有很多有益的心血管保護(hù)作用，例如改善內(nèi)皮功能異常、增加一氧化氮(N0)生物利用率［9］。他汀對(duì)于內(nèi)皮功能的改善作用已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但機(jī)制尚待研究。而瑞舒伐他汀作為新一代的他汀已經(jīng)被證實(shí)擁有更強(qiáng)的降脂效果及穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)粥樣斑塊，改善血管內(nèi)皮功能的治療作用［10］，Werner等［3］觀察到給予小鼠瑞舒伐他汀，其外周血循環(huán)早期內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)在用藥后24 h即有明顯升高并持續(xù)到用藥24 h后。同時(shí)瑞舒伐他汀明顯促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷的再內(nèi)皮化并抑制血管內(nèi)膜的過度增生。試驗(yàn)證明了瑞舒伐他汀能增強(qiáng)晚期EPCs增生、遷移的功能，抑制細(xì)胞的凋亡。與傳統(tǒng)他汀如辛伐他汀、洛伐他汀相比，無需經(jīng)肝臟代謝轉(zhuǎn)化為活性二羥酸，因此可直接以非前體藥物應(yīng)用。

Llevadot等［11］發(fā)現(xiàn)，0.1μmol/L 辛伐他汀可明顯改善早期EPCs的增生功能達(dá)19%(A值，0.47±0.04 vs 0.56±0.03;P＜0.01)，提高其遷移能力達(dá)12倍(細(xì)胞計(jì)數(shù)，5 ±4 vs 64 ±26;P ＜0.01);Loomans等［12］發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol/L阿托伐他汀可將高血糖模型小鼠骨髓來源早期EPCs的數(shù)量恢復(fù)至正常(增加30% ～40%)。與Llevadot研究相比，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀改善晚期EPCs增生功能的作用更強(qiáng)(33%)，也可提高細(xì)胞的遷移功能，證明瑞舒伐他汀能夠明顯提高晚期EPCs增生、遷移的功能，減少細(xì)胞的凋亡，體現(xiàn)了細(xì)胞功能的改善與藥物濃度及作用時(shí)間的相關(guān)性。說明瑞舒伐他汀較傳統(tǒng)他汀對(duì)EPCs同樣存在保護(hù)作用，可以通過促進(jìn)新生血管的形成而促進(jìn)心肌梗死后心肌修復(fù)，為他汀類藥物的心血管保護(hù)機(jī)制提供了更豐富的理論基礎(chǔ)。但由于既往實(shí)驗(yàn)多為早期EPCs，故在改善EPCs細(xì)胞功能方面，瑞舒伐他汀是否優(yōu)于傳統(tǒng)他汀，還需要進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)證明。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然高濃度(100 μmol/L)時(shí)瑞舒伐他汀細(xì)胞功能仍較對(duì)照組強(qiáng)，但隨著濃度增加，高劑量的瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs的保護(hù)作用已經(jīng)降低。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)，與臨床實(shí)驗(yàn)差距較大:首先實(shí)驗(yàn)對(duì)象為大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞，非人類的內(nèi)皮祖細(xì)胞;其次本實(shí)驗(yàn)中瑞舒伐他汀直接處理細(xì)胞，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)代謝較復(fù)雜，口服藥量與血藥濃度的關(guān)系估算困難，而且大鼠與人類的用藥量或血藥濃度關(guān)系直接以體質(zhì)量換算可能欠妥，故本實(shí)驗(yàn)未能給出臨床上瑞舒伐他汀的血藥濃度與0.1 μmol/L這個(gè)最佳濃度的關(guān)系。但在相關(guān)臨床研究中Hristov等［13］發(fā)現(xiàn)，冠心病患者高劑量(40 mg/d)、長期應(yīng)用(＞8周)他汀后，外周血中早期EPCs數(shù)量明顯減少，且與他汀劑量明顯相關(guān)。同樣提示臨床加大他汀藥物劑量與血管內(nèi)皮功能的改善可能不成正比。

受實(shí)驗(yàn)條件及時(shí)間限制，本實(shí)驗(yàn)未能涉及瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs功能影響的機(jī)制問題。但現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)他汀可通過多種機(jī)制改善EPCs的功能，如:通過增多Akt磷酸化和NO量，改善體外培養(yǎng)的早期EPC的增生、遷移功能，降低凋亡水平［14］。但既往研究［15-17］多針對(duì)早期EPCs，且不同研究中所采用的藥物及濃度不同，處理時(shí)間、實(shí)驗(yàn)方法也存在很多差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦不統(tǒng)一，因此關(guān)于瑞舒伐他汀對(duì)晚期EPCs功能影響的機(jī)制是否與既往文獻(xiàn)一致尚需進(jìn)一步證實(shí)。

結(jié)論:瑞舒伐他汀能夠提高晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的增生、遷移功能，減少細(xì)胞的凋亡，且具有一定的濃度及時(shí)間依賴性。

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