何 平 伍冀湘* 鐘晨熙 戴 潔 梁杰雄 李 洋 許英晨 于 瑋

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院普外科，北京100029;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京100069)

誘騙受體3(decoy receptor 3，DcR3)/又稱腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)6B/TR6是1998年P(guān)itti等［1］發(fā)現(xiàn)的一種可溶性TNFR超家族的新成員。它可競爭性地與腫瘤壞死因子超家族成員人凋亡相關(guān)因子配體(people apoptosis related related factor ligand，F(xiàn)asL)、皰疹病毒侵入介體配體(herpes virus intrusion fixator lagand，LIGHT)及腫瘤壞死因子樣配體(tumor necrosis factor sample ligand，TLIA)結(jié)合，在腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都發(fā)揮著重要的作用［2］。構(gòu)建人特異性DcR3小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系，檢測內(nèi)源性DcR3基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究DcR3在體內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的免疫逃逸等相關(guān)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑

1)細(xì)胞培養(yǎng):RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國GIB-CO公司)，胎牛血清(天津川頁生化制品公司)。

2)siRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建、提取及轉(zhuǎn)染:pSUPER質(zhì)粒(中日友好醫(yī)院腎病中心饋贈(zèng))，DcR3的siRNA特異引物合成(上海生工生物工程公司，詳見表1);T4聯(lián)接酶、限制性內(nèi)切酶(日本寶生物公司)，質(zhì)粒中提試劑盒(美國Promega公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)。

3)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及多聚酶鏈反應(yīng)試劑:總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程公司)，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑(華美生物工程公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司，詳見表2)。

4)蛋白免疫印跡:小鼠抗人DcR3單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(美國Santa Cruz公司);ECL發(fā)光試劑盒(美國 Roche公司)。

表1 DcR3的siRNA特異引物合成Tab.1 DcR3 siRNA specific primer synthesis

表2 PCR引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2 方法

1)siRNA序列篩選:自GeneBank中查找人DcR3全序列，編號(hào)AF104419。通過Dharmacon公司的網(wǎng)上siRNA設(shè)計(jì)工具siDESIGNR○Center，設(shè)計(jì)siRNA序列;根據(jù)結(jié)果，選擇最佳序列進(jìn)行合成。

2)DcR3的pSUPER表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶(BgⅢ/HindⅢ)將pSUPER載體進(jìn)行酶切處理;將配對(duì)的2條引物加入延伸緩沖液形成雙鏈，經(jīng)磷酸化后處理后與經(jīng)載體聯(lián)接。聯(lián)接后的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。鑒定成功后進(jìn)行中提，以用于轉(zhuǎn)染。

3)SW480細(xì)胞培養(yǎng):將SW480用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下孵育2～3 d后，傳代1次，計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于100 mm培養(yǎng)皿中，2 d后細(xì)胞達(dá)到80%融合，融合后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將 6 μg純化的質(zhì)粒以 Lipofectamine 2000為介質(zhì)轉(zhuǎn)染入SW480。

5)反轉(zhuǎn)錄及PCR測定:提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄所獲cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，檢測DcR3的表達(dá)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后行凝膠成像后，用Scion Image 4.03進(jìn)行分析，結(jié)果以所測樣品指標(biāo)的吸光度值與作為內(nèi)參照的β-actin吸光度比值來表示。

6)蛋白免疫印記:SW480轉(zhuǎn)染48 h后，分別加入十二烷基硫酸鈉樣本緩沖液裂解細(xì)胞(內(nèi)含100 mmol/L Tris-HCl、2%SDS、5% β 巰基乙醇及10%甘油)，冰上裂解10 min，刮下細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物，超聲波粉碎后煮沸5 min，離心，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，分別用小鼠抗人DcR3單克隆抗體(第一抗體)及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(第二抗體)進(jìn)行雜交，ECL試劑盒發(fā)光，暗室曝光X片，凝膠掃描分析系統(tǒng)(Scion Image 4.03軟件)測定吸光度。

7)MTT法檢測DcR3-siRNA對(duì)SW480細(xì)胞生長的影響:取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μL，每組6孔，接種24 h后棄去上清，分別加入 pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和 pSUPER-Con(終濃度0.1 nmol/L)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中無血清繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再各補(bǔ)加無雙抗含10%小牛血清的RPMI-1640 100 μL。于48 h后加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心棄上清，加入DMSO 150 μL，震蕩15 min后，酶標(biāo)儀下讀取吸光度(A)。

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較行單因素方差分析和均數(shù)多重比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DcR3特異性siRNA篩選與構(gòu)建

本研究使用的pSUPER載體含H1Ⅲ型聚合酶啟動(dòng)子，能精確高效地轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾狀RNA，進(jìn)而在體內(nèi)被切割成可以發(fā)揮RNAi效應(yīng)的siRNA［3］。

根據(jù) GeneBank中的人 DcR3全序列(AF104419)，利用siDESIGNR○Center，(http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx)，設(shè)計(jì) siRNA。其中 GGAACTACCTGGAGCGCTG(345～364)和ACGCGGAGTGGCAGAAACA(181～200)兩段序列的積分最高，被選為本實(shí)驗(yàn)中的siRNA的靶序列，命名為 siRNA-1、siRNA-2。按pSUPER載體要求合成引物并聯(lián)接入載體后，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定和DNA序列分析，序列與預(yù)期完全相符，證明克隆構(gòu)建正確。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pSUPER-hDcR3-1和pSUPER-h DcR3-2，無關(guān)序列重組質(zhì)粒為pSUPER-Con(為pSUPER-hDcR3-1的錯(cuò)配序列)(圖1)。

圖1 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒DcR3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒Fig.1 EcoRⅠand HindⅢdouble enzyme identification of recombinant plasmid DcR3 siRNA expression plasmid

2.2 Dcr3 siRNA對(duì)SW480中DcR3 mRNA表達(dá)的抑制作用

將重組質(zhì)粒pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和pSUPER-Con瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞，36 h后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參照，檢測DcR3的mRNA的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每組樣本例數(shù)為6。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pSUPER-hDcR3-1后，細(xì)胞DcR3 mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.01);轉(zhuǎn)染pSUPER-hDcR3-2后，細(xì)胞DcR3 mRNA表達(dá)也有顯著下降(P＜0.01)，說明針對(duì)DcR3的siRNA在真核細(xì)胞中表達(dá)后可以抑制DcR3的mRNA表達(dá)(圖2，表3)。

表3 siRNA對(duì)SW480中DcR3 mRNA表達(dá)的抑制作用Tab.3 siRNA inhibition of DcR3 mRNA expression in SW480(±s，n=6)

表3 siRNA對(duì)SW480中DcR3 mRNA表達(dá)的抑制作用Tab.3 siRNA inhibition of DcR3 mRNA expression in SW480(±s，n=6)

* P＜0.01 vs pSUPER-Con group;DcR3:decoy receptor 3.

Group β-actin DcR3 Relative expression quantity pSUPER-Con 65.05±1.42 45.35±2.22 0.70±0.42 pSUPER-hDcR3-1 71.72±2.04 21.71±3.28 0.30±0.48*pSUPER-hDcR3-2 70.33±2.32 26.20±2.82 0.37±0.21*

圖2 RT-PCR方法檢測siRNA對(duì)SW480中DcR3 mRNA表達(dá)的作用Fig.2 Effects of RT-PCR on siRNA DcR3 mRNA expression in SW480

2.3 Dcr3 siRNA對(duì)SW480中DcR3的蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用

收 集 pSUPER-hDcR3-1、pSUPER-hDcR3-2和pSUPER-Con瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48 h的SW480細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，上樣量為30g/孔，以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測細(xì)胞中DcR3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每組樣本例數(shù)為6。Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后pSUPER-hDcR3-1后細(xì)胞DcR3的蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著下降(P＜0.01);轉(zhuǎn)染pSUPER-hDcR3-2后，細(xì)胞DcR3蛋白質(zhì)的表達(dá)也有顯著下調(diào)(P＜0.01)，表明針對(duì)DcR3的siRNA可以抑制DcR3的蛋白表達(dá)(圖3，表4)。

2.4 Dcr3 siRNA對(duì)SW480細(xì)胞生長的影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，pSUPER-hDcR3-1組的吸光值為0.762±0.051(n=6)，48 h細(xì)胞存活率為51%;pSUPER-hDcR3-2組的吸光值為0.737±0.048(n=6)，48 h細(xì)胞存活率為48%，與pSUPER-Con組的吸光值為0.842±0.061(n=6)，48 h細(xì)胞存活率79%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表4 siRNA對(duì)SW480中DcR3蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of siRNA on protein expression of DcR3 in SW480(±s，n=6)

表4 siRNA對(duì)SW480中DcR3蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of siRNA on protein expression of DcR3 in SW480(±s，n=6)

* P＜0.01 vs pSUPER-Con group;DcR3:decoy receptor 3.

Group GAPDH DcR3 Relative expression quantity pSUPER-Con 147.12±5.27 59.64±3.77 0.41±0.04 pSUPER-hDcR3-1 140.28±3.38 17.87±2.86 0.13±0.02*pSUPER-hDcR3-2 149.70±6.21 24.02±1.29 0.16±0.03*

圖3 Western blotting檢測SW480中DcR3的表達(dá)Fig.3 Western blotting method for detection DcR3 expression in SW480

3 討論

TNFR超家族新成員DcR3與TNFR基因超家族成員有同源性的EST，從人胚胎肺中分離出一條新的全長 cDNA，DcR3 mRNA全長1.2 kb，加工成熟的DcR3蛋白由271個(gè)氨基酸組成，其相對(duì)分子質(zhì)量約35 000［4］。

研究［5-6］表明，DcR3表達(dá)于某些人類正常組織包括腦、肝、肺及成人脾、胃腸道和臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，在肺癌、胃腸道腫瘤、腦惡性膠質(zhì)瘤、胰腺癌和肝癌等惡性腫瘤組織中都有不同程度的高度表達(dá)。DcR3通過和腫瘤壞死因子超家族成員配體LIGHT、Fas/FasL和 TL1A競爭性結(jié)合，從而抑制 LIGHT、FasL、TL1A介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞增生等，并呈劑量依賴性，使腫瘤細(xì)胞逃逸肌體免疫系統(tǒng)的清除及細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，與某些腫瘤的發(fā)病有關(guān)。并且，DcR3還通過阻斷TL1A的作用而誘導(dǎo)腫瘤血管形成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［7］。因此，DcR3在抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)中的獨(dú)特作用以及在許多人類惡性腫瘤中的高度表達(dá)決定了其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

鑒于DcR3在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，本課題組構(gòu)建了表達(dá)DcR3 siRNA的重組質(zhì)粒pSUPER-hDcR3，以細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將包含特異性DcR3 siRNA的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480后，通過阻斷與其特異性互補(bǔ)的mRNA表達(dá)，阻止其翻譯成蛋白質(zhì)，用RTPCR、Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞DcR3的分泌量明顯減少，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA各組對(duì)細(xì)胞增生有不同程度的抑制效，說明本文所構(gòu)建pSUPER-hDcR3重組質(zhì)粒在結(jié)腸癌細(xì)胞中能與DcR3的mRNA特異性結(jié)合，從而使其翻譯程序停止。siRNA可作為一種調(diào)控特定基因表達(dá)的手段，并且可按劑量來調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)或功能，具有安全性高、特異性強(qiáng)、作用確切的特點(diǎn)。盡管目前存在siRNA專一性轉(zhuǎn)移、在體內(nèi)進(jìn)入靶細(xì)胞前降解等諸多問題尚不能完全解決，但具有強(qiáng)效抑制作用的siRNA可解除DcR3對(duì)FasL、LIGHT及TL1A三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)的抑制，從而使機(jī)體正常發(fā)揮清除腫瘤細(xì)胞及活化免疫細(xì)胞的功能，對(duì)腫瘤基因治療仍具有很大價(jià)值。有研究［8-9］證實(shí)通過封閉DcR3的基因表達(dá)可能使腫瘤細(xì)胞趨向凋亡。抑制后生物學(xué)效應(yīng)對(duì)于siRNA來說，意義更為顯著，本研究為進(jìn)一步探討封閉DcR3基因表達(dá)可否使腫瘤細(xì)胞凋亡而起到治療腫瘤的作用、是否與抗癌藥物具有協(xié)同作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

總之，應(yīng)用DcR3的特異性SiRNA抑制DcR3基因表達(dá)，通過測定DCR3的mRNA及蛋白表達(dá)量，為進(jìn)一步深入了解DcR3在體內(nèi)作用的相關(guān)機(jī)制，以及對(duì)腫瘤患者病情進(jìn)展的檢測、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的估計(jì)提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并對(duì)開發(fā)相關(guān)生物制劑逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)肌體免疫的逃避，開辟腫瘤預(yù)防與治療的新領(lǐng)域，具有重要理論和實(shí)際意義。

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