張 瑩 孫秀靜 朱圣韜

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院消化內科，北京100050;2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化內科，北京100050)

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因定位于人染色體6p21.3，其編碼的蛋白由2條類似的肽鏈組成的糖蛋白二聚體所構成。目前對腫瘤的研究［1］表明，VEGF能夠特異性地刺激血管內皮細胞增生、促進其遷移，并參與新生血管的形成，也是目前已知的最強血管生成因子和內皮細胞選擇性促有絲分裂因子，因而被認為是與惡性腫瘤新生血管形成、促進腫瘤細胞增生聯(lián)系最緊密的一個細胞因子。當前在對于惡性腫瘤的研究中，肺癌、宮頸癌、胃癌、以及腎細胞癌等的發(fā)生風險與VEGF的基因多態(tài)性密切相關［2-5］，但截止到目前，尚未有研究涉及VEGF基因多態(tài)性、尤其是單倍型與結腸癌易感性關聯(lián)報道。在以往基因功能表達的實驗研究［6］中，已證實VEGF基因中存在若干個多態(tài)性位點，其中一些多態(tài)性位點的改變能夠調節(jié)或者改變VEGF基因的蛋白表達。本研究采用病例-對照研究方法，運用PCR-RFLP技術檢測VEGF基因啟動子區(qū)多態(tài)性并構建其單倍型，擬探討VEGF基因啟動子區(qū)域-460(NCBI dbSNP rs833061)與-634(NCBI db-SNP rs2010963)多態(tài)性位點的單倍型在中國漢族人群中的分布，以及VEGF基因單倍型對結腸癌發(fā)生風險的易感關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 病例與對照的選擇

病例組選自2007年3月至2011年3月在首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院和附屬北京友誼醫(yī)院消化內科保存的臨床病例資料中完整的結腸癌患者的血液樣本共182例，其中男98例，女84例，平均年齡(55.13±10.26)歲。病例中腺癌125例，黏液癌38例、未分化癌19例;根據(jù)病理學診斷以及患者相應的輔助檢查確定病例組結腸癌患者的TNM分期，其中Ⅰ-Ⅱ期患者 97 例(47/182，53.30%)，Ⅲ-Ⅳ患者例85(85/182，46.70%);遠處轉移患者(M1)總計51例(51/182，28.02%)。入選標準:所有患者在血液標本采集前均未有輸全血或其他成分輸血記錄，每例患者均經(jīng)術后或內鏡下組織病理學確診;剔除標準:患者合并有第二原發(fā)惡性腫瘤或其他自身免疫系統(tǒng)疾病。對照組選自首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院和附屬北京友誼醫(yī)院體檢中心的健康人群血液樣本，年齡與性別等均和病例組相匹配;對照組中男117例，女99例，平均年齡(56.91±8.54)歲，共216例。兩組人群中個體之間均無血緣關系，均系中國漢族人群。

1.2 基因組DNA抽提

每位研究個體均采集用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的靜脈全血2 mL，在蛋白酶K消化之后采用苯酚/氯仿提取全血基因組DNA，總計提取結腸癌患者、健康正常人外周血DNA 398例，提取的基因組DNA溶解于TE中，并保存于-80℃冰箱。

1.3 多態(tài)性位點的選擇及引物設計

在Gene Bank中檢索到VEGF基因的全長序列(GenBank Accession number:AF 095785.1)，并參考國外有關文獻［7］進行引物的設計與合成，本研究引物由上海申友生物技術有限公司合成。-460T/C位點:forward-CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG，Reverse-TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC;-634G/C位點:forward-TTGCTTGCCATTCCCCACTTG，Reverse-CCGAAGCGAG AACAGCCCAGAA。

1.4 PCR反應體系及反應條件

PCR擴增體系及程序如下:ddH2O 40.5 μL，10×PCR 緩沖液(含 1.5 mmol/L Mg2+)5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶 5 U(Promega Company，USA)，上、下游引物各 1 μL(20 μmol/L)，DNA 模板 1 μL(500 ng)。擴增采用程序:94℃預變性2 min后，94℃變性40 s，退火40 s，退火溫度分別為60.0℃(-460T/C)、54.5 ℃(-634G/C)，之后72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10 min(PE Biosystems，USA)。PCR產(chǎn)物的純化采用Millipore公司的Multiscreen-PCR純化板進行純化(Millipore Company，USA)。

1.5 RFLP方法檢測-460T/C與-634G/C位點基因型

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別采用限制性內切酶Bsa-HI和 BsmFI(New England Biolabs Beverly，Ma，USA)對-460T/C、-634G/C這兩個位點進行酶切基因分型。每個反應體系為20 μL，其中 DNA 約1 μg、內切酶5 U、加各自內切酶相應的10×Buffer 2 μL、最后加ddH2O至20 μL;根據(jù)NEB公司操作手冊BsaHI內切酶水浴溫度為37℃、BsmFI內切酶水浴溫度為65℃，水浴時間均為12 h過夜。酶切結束后立即進行瓊脂糖電泳并進行EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)內判斷每一個體-460T/C與-634G/C位點的基因型(Agarose-1000;Gibco BRL，USA，使用濃度為 2%)。

1.6 -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點的單倍型構建

基于-460T/C與-634G/C兩個多態(tài)性位點均位于VEGF基因啟動子區(qū)域，并且相互毗鄰，故對兩個多態(tài)性位點在398個體中的基因型，采用以Bayes-ian algorithm(貝葉斯算法)為基礎的 PHASE軟件(PHASE 1.0)進行逐個個體單倍體的構建［8］。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用統(tǒng)計學分析軟件SPSS 13.0(SPSS 13.0 for Windows，Chicago，IL)，利用 Chi-square Test驗證基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，并檢驗兩組之間性別、吸煙、飲酒、腫瘤家族史、等位基因位點等的分布差異;利用Mann Whitney-U檢驗比較兩組人群之間年齡分布的差異;以OR值(odds ratio)及其95%CI(confidence intervals)甄別多態(tài)性、單倍型與結腸癌風險之間的相關性;選擇非條件Logistic回歸模型統(tǒng)計分析OR值及95%CI，其結果均經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤家族史等混雜因素校正后取得;所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料的統(tǒng)計學檢驗

統(tǒng)計分析結果表明兩組人群之間顯示良好的匹配性，Mann Whitney-U方法比較兩組之間年齡分布的差異(P=0.086)，差異無統(tǒng)計學意義;在病例與對照組的統(tǒng)計分析中，Chi-square Test檢驗結果顯示性別、吸煙、飲酒等差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而在腫瘤家族史的對比結果提示，結腸癌患者中其家族腫瘤史顯著高于正常對照組(P=0.001)(表1)，兩組比較有統(tǒng)計學意義。

表1 病例與對照組的一般資料Tab.1 Characteristics of the colorectal cancer patients and normal controls n(%)

2.2 -460T/C與-634G/C位點多態(tài)性與結腸癌的關聯(lián)分析

182例結腸癌患者與216例健康對照人群中，兩個多態(tài)性位點經(jīng)PCR-RFLP檢測后結果顯示VEGF基因-460T/C與-634G/C位點的多態(tài)性在我們檢測的樣本中均存在;同時分別進行兩個多態(tài)性位點各自的3種基因型數(shù)據(jù)讀取與統(tǒng)計(圖1)，等位基因的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

圖1 VEGF基因啟動子區(qū)域-460與-634多態(tài)性位點凝膠成像圖Fig.1 Product of the VEGF-460 and VEGF-634 polymorphisms in the promoter region of the VEGF gene shown on agarose electrophoresis

VEGF基因中-460T/C多態(tài)性位點在檢測的結腸癌患者與對照人群中，等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義〔P=0.002，OR=1.67(95%CI:1.33-4.72)〕;雜合型T/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義〔P=0.021，OR=1.61(95%CI:2.39-9.75)〕;多態(tài)純合型C/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布也同樣具有統(tǒng)計學意義〔P=0.001，OR=3.12(95%CI:5.82-11.74)〕。-634G/C位點多態(tài)性在正常人群與結腸癌患者之間等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.103);-634G/C多態(tài)性位點基因型頻率在兩組人群間差異也無統(tǒng)計學意義:雜合型(G/C P=0.082)，多態(tài)純合型(C/C P=0.051)，詳見表2。

2.3 -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點單倍型頻率統(tǒng)計分析

-460T/C與-634G/C多態(tài)性位點在VEGF基因啟動子區(qū)域內相互毗鄰，針對病例與對照組中-460T/C與-634G/C基因多態(tài)性位點的基因型，本課題組利用PHASE1.0軟件進行每個個體單倍體的構建［8］，結果共有4種單倍體組合:A=T-G、B=T-C、C=C-G、D=C-C(表3);并對每個個體(總398例)逐一進行了--/-- 、--/Haplotype、Haplotype/Haplotype 3種單倍型的統(tǒng)計，由于Haplotype/Haplotype純合單倍型出現(xiàn)的頻率相對較低，本課題組進行統(tǒng)計分析時將--/Haplotype、Haplotype/Haplotype合并。結果表明:前3種單倍型T-G、T-C、C-G在結腸癌患者與對照組人群之間均無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.086，P=0.194，P=0.201);而單倍型C-C在結腸癌組與對照組人群之間的差異有統(tǒng)計學意義〔P＜0.001，OR=4.28(95%CI:2.77-13.41)(表3)〕。

表2 VEGF基因啟動子區(qū)多態(tài)性與結腸癌的關聯(lián)分析Tab.2 The associated analysis between the colorectal cancer and VEGF gene promoter polymorphismsn(%)

3 討論

Ferrara于1989年從牛垂體濾泡星狀細胞體外培養(yǎng)液中分離純化的血管內皮生長因子(VEGF)，又稱血管通透因子，是具有促血管內皮細胞有絲分裂活性的糖基化多肽分泌因子。在惡性腫瘤的生長過程中，其通過受體的作用促細胞增生作用體現(xiàn)于2個方面:一方面促進微血管內皮細胞增生、分化、遷延，而從另一方面則能夠促使微血管形成與通透性增加，最終促進惡性腫瘤細胞的生長與遠處遷移［9-10］。在VEGF促有絲分裂活性的分子機制中，2種高親和力酪氨酸激酶受體發(fā)揮著重要的生物學效應，這2種受體即含激酶插入?yún)^(qū)受體(KDRPflk-1，VEGFR-2)和FMS-樣酪氨酸激酶-1(FLT-1，VEGFR-1)，兩者均為跨膜蛋白，與配體結合后形成二聚體，引發(fā)一系列的連鎖生化反應［12-13］。

表3 VEGF基因啟動子區(qū)-460T/C與-634G/C構建的單倍型與結腸癌的關聯(lián)分析Tab.3 Association analyses of the colorectal cancer and the haplotypes constituted by the-460T/C and-634G/C polymorphisms of VEGF gene promoter n(%)

結腸癌的發(fā)生發(fā)展不僅具有家族聚集性和明顯的個體差異，并且也是多因素、多基因變異累積的癌變過程。近期的一系列相關研究［14-15］認為，在結腸癌的遺傳易感性方面，VEGF在血漿的表達水平高低是影響結腸癌易感性的重要環(huán)節(jié)，而VEGF基因的多態(tài)性的改變，將導致相應的VEGF血漿水平表達水平或活性改變，從而引起對結腸癌易感性的個體化差異。

參與調節(jié)VEGF表達合成的因素較多，近年來的研究表明，VEGF基因多態(tài)性與其活性密切相關，Stevens A等［16］認為攜帶有-460/+405多態(tài)性能夠顯著改變VEGF基因啟動子的活性和反應性，這種多態(tài)性的改變將導致啟動子活性較野生型提高了71%。我們此次研究發(fā)現(xiàn):在182例結腸癌患者與216例對照的人群中，VEGF基因啟動子區(qū)域-460T/C與-634G/C位點多態(tài)性在中國漢族人群中不僅普遍的存在，而且-460T/C多態(tài)性位點等位基因頻率在兩組人群中差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，其雜合型T/C及多態(tài)純合型C/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但-634G/C多態(tài)性位點在兩組人群之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在研究疾病的遺傳易感因素當中，對于疾病的發(fā)生與發(fā)展每一個SNP的存在并不只是起到一個孤立的作用，多個SNP之間存在著一定的內在關聯(lián)與相互作用，單倍型則能夠更好地體現(xiàn)這種遺傳關聯(lián)，因此對于揭示多個SNPs與疾病的易感關聯(lián)，單倍型的研究是一種較好的手段［17］。由于VEGF基因啟動子區(qū)域-460T/C與-634G/C多態(tài)性位點相互毗鄰，我們進一步進行了VEGF基因單倍型與結腸癌的關聯(lián)分析。研究結果顯示，兩個多態(tài)性位點共構建4種單倍體，其中-460位點C與-634位點C所組成的單倍型C-C在兩組人群中差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，表明具有單倍體C-C個體(與其他單倍體雜合或者本身純合存在時)較之不含該單倍體的個體對于結腸癌的發(fā)生，能夠增加其4.28倍的罹患風險。

綜上所述，VEGF基因啟動子區(qū) -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點所構成的單倍型能夠影響著結腸癌的發(fā)生，成為結腸癌的易感風險因素;但關于該兩個位點的多態(tài)性以及單倍型如何調控VEGF的血漿水平表達狀況、以及如何參與結腸癌的發(fā)生和發(fā)展的機制仍需進一步研究探討。

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