李 陽 李 洋 程 杉 葛志成 司 楊 賀俊崎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院普外科，北京100050)

乳腺癌是一種異質(zhì)性很高的惡性腫瘤，近年來，腫瘤相關(guān)基因表達的變化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用已引起廣泛重視。鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1，NHERF1)是新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌抑制基因［1］。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)是被發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因［2］，可參與細胞周期的調(diào)控、促進凋亡和抑制腫瘤的發(fā)生。雌激素受體(estrogen receptor，ER)不僅存在于乳腺、子宮等雌激素靶組織，在肺癌等多種非雌激素靶器官組織中也廣泛存在［3］。有文獻［4］報道，NHERF1 介導(dǎo)雌激素受體調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達，影響了PTEN相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而影響了乳腺癌的惡性表型。我們采用免疫組織化學(xué)方法研究了NHERF、PTEN和雌激素受體亞型ERα蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達情況，以期在臨床水平探討NHERF1、PTEN和ERα蛋白在乳腺癌發(fā)生中的作用、相互關(guān)系及其臨床意義，為揭示NHERF1通過調(diào)節(jié)PTEN表達而影響乳腺癌發(fā)展的機制提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

選取2008年1月至2009年12月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院手術(shù)獲取的乳腺癌標(biāo)本4例，患者全部為女性，術(shù)前未進行化療和放療。采取4例患者癌旁正常組織為對照組。應(yīng)用BloomRichardsen’s組織學(xué)分級，參照Elston和Ellis改良方法［5］，對4例乳腺癌組織進行分級:Ⅰ級3例，Ⅱ級1例。病理學(xué)類型均為浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊型)。

1.2 方法

NHERF1鼠抗人單克隆抗體、PTEN鼠抗人單克隆抗體、ERα鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)，S-P免疫組化試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。免疫組化染色SP法，微波抗原修復(fù)，按試劑盒說明操作，蘇木素襯染。

1.3 結(jié)果判定

NHERF1陽性細胞為棕黃色或黃色顆粒位于導(dǎo)管上皮細胞，而只出現(xiàn)于脂肪組織內(nèi)判定為非特異性染色;PTEN、ERα陽性細胞為棕黃色或黃色顆粒位于細胞質(zhì)或膜。在癌組織以及癌旁組織隨機選擇5個高倍鏡視野，計數(shù)100個細胞中染色陽性細胞的灰度值，并計算癌組織與癌旁組織的灰度值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用雙側(cè)t檢驗，通過P值大小檢驗癌組織與癌旁組織表達量差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用配對t檢驗，等級資料的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)系數(shù)rs描寫。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NHERF1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中NHERF1表達量的平均灰度值為201.47;而對應(yīng)癌旁組織中NHERF1表達量的平均灰度值為477.65，通過配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖1)。

圖1 NHERF1蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.1 NHERF1 expression in breast cancer

2.2 PTEN在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中PTEN表達量的平均灰度值為179.23;而對應(yīng)癌旁組織中PTEN表達量的平均灰度值為373.34，通過配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖2)。

圖2 PTEN蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.2 PTEN expression in breast cancer

2.3 ERα在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中ERα表達量的平均灰度值為389.47;而對應(yīng)癌旁組織中ERα表達量的平均灰度值為177.12，通過配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖3)。

圖3 ERα蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.3 ERα expression in breast cancer

2.4 乳腺癌組織中NHERF1蛋白表達與PTEN表達的關(guān)系

通過Spearman等級相關(guān)檢驗NHERF1的表達與PTEN的表達呈正相關(guān)(rs=0.611，P＜0.01)。

3 討論

多數(shù)乳腺組織中ERα為激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄子，介導(dǎo)細胞激素反應(yīng)。雌激素與其受體結(jié)合，促進新的蛋白的合成，其中包括孕激素受體的合成，其調(diào)節(jié)乳腺細胞的生長、分化，是乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)志之一。本研究中結(jié)果顯示，ERα在乳腺癌組織表達顯著高于正常乳腺組織，提示ERα的高表達可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

大量研究［6］結(jié)果顯示，NHERF1有調(diào)節(jié)細胞增生的潛在功能。在30%的乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)NHERF-1表達下調(diào)，腫瘤的發(fā)生可能是由于NHERF1蛋白表達水平較低或消失，使其抑癌作用減弱或消失而導(dǎo)致。抑制乳腺癌細胞T47D或MCF7中內(nèi)源表達的NHERF-1后，細胞增生能力增強，對裸鼠的致瘤能力也增強。抑制NHERF-1表達后，細胞從G1到S期進展加快，伴隨cyclin E表達增加和Rb磷酸化水平升高。由此推測，正常NHERF1在乳腺上皮細胞中的功能是阻止細胞周期進展。NHERF1對細胞周期的調(diào)節(jié)作用與它在乳腺中的腫瘤抑制活性相關(guān)［7］。本研究結(jié)果顯示，NHERF1在乳腺癌組織表達顯著低于正常乳腺組織，提示NHERF1可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。雌激素受體ERα作為NHERF1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控NHERF1 mRNA的表達，雌激素能夠通過ERα誘導(dǎo)細胞內(nèi)NHERF1的表達［8］，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)，在 ERα高表達的乳腺癌組織中NHERF1低表達，可見，腫瘤組織中NHERF1表達異常，腫瘤組織中NHERF1的表達很可能受到多種因素的調(diào)節(jié)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)是1997年發(fā)現(xiàn)的一個具有雙磷酸酶活性的抑癌基因［9-10］，它在細胞的生長、增生、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等多種生命活動過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。PTEN功能的異常可以引發(fā)多種腫瘤。PTEN基因的缺失以及體細胞性突變經(jīng)常發(fā)生于膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌以及小細胞肺癌中［11］。有研究［4］表明，NHERF1 通過 PDZ-I結(jié)構(gòu)域與抑癌蛋白PTEN有相互作用，并且可提高細胞內(nèi)PTEN的蛋白表達量，而其mRNA表達水平?jīng)]有增加;利用環(huán)己酮抑制新蛋白合成后，檢測到NHERF-1的表達可以抑制PTEN蛋白的降解速度，說明NHERF1能夠在蛋白水平促進PTEN蛋白的穩(wěn)定性。本研究對10例乳腺癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織中PTEN蛋白檢測結(jié)果顯示，PTEN蛋白在乳腺癌組織中表達顯著低于正常乳腺組織，并且NHERF1的表達與PTEN的表達呈顯著正相關(guān)(r=0.611，P＜0.01)。由此可見，乳腺癌組織中PTEN蛋白表達高低與NHERF1的表達情況有很大的關(guān)系。NHERF1很可能通過對PTEN蛋白穩(wěn)定性的作用，影響了PTEN相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而影響了乳腺癌的惡性表型。

許多學(xué)者［12-13］認(rèn)為，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段，至少有2個或2個以上功能不同，異常激活的基因各自發(fā)生作用，促進了細胞的癌變［12］。本課題組研究了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中 NHERF1、PTEN、ERα在乳腺癌的表達情況及其相互關(guān)系，研究結(jié)果顯示NHERF1和PTEN的表達呈正相關(guān)，在腫瘤組織中NHERF1表達量降低，PTEN的表達也會下降，很可能是由于NHERF1的表達影響了PTEN蛋白的表達及穩(wěn)定性，從而影響了PTEN在乳腺癌組織中的蛋白水平，進而調(diào)節(jié)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，表明在腫瘤細胞的增生侵襲過程中，多種因子相互作用，參與腫瘤生成發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。

綜上所述，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生和發(fā)展與其生物學(xué)特征的分布有一定規(guī)律可循，聯(lián)合檢測NHERF1、PTEN可作為制定綜合治療方案的依據(jù)，用來指導(dǎo)臨床用藥和判斷預(yù)后。

［1］Dai J L，Wang L，Sahin A A，et.al.NHERF(Na+/H+exchanger regulatory factor)gene mutations in human breast cancer［J］.Oncogene，2004，23(53):8681-8687.

［2］Steck P A，Pershouse M A，Jasser S A，et al.Identification of a candidate tumor suppressor gene MMAC1，at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers［J］.Nat Genet，1997，15(4):356-362.

［3］Sica G，Wagner P L，Altorki N，et al.Immunohistochemical expression of estrogen and progesterone receptors in primary pulmonary neuroendocrine tumors［J］.Arch Pathol Lab Med，2008，132(12):1889-1895.

［4］Yang L，Wang Y，Chen P，et al.Na(+)/H(+)exchanger regulatory factor 1(NHERF1)is required for the estradiol-dependent increase of phosphatase and tensin homolog(PTEN)protein expression［J］.Endocrinology，2011，152(12):4537-4549.

［5］Elston C W，Ellis I O.Pathological prognostic factors in breast cancer.I.The value of histological grade in breast cancer:experience from a large study with long-term followup［J］.Histopathology，2002，41(3A):154-161.

［6］Voltz J W，Weinman E J，Shenolikar S.Expanding the role of NHERF，a PDZ-domain containing protein adapter，to growth regulation［J］.Oncogene，2001，20(44):6309-6314.

［7］Shao Z M，Nguyen M，Barsky S H.Human breast carcinoma desmoplasia is PDGF initiated［J］.Oncogene，2000，19(38):4337-4345.

［8］Ediger T R，Kraus W L，Weinman E J，et al.Estrogen receptor regulation of the Na+/H+exchange regulatory factor［J］.Endocrinology，1999，140(7):2976-2982.

［9］Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer［J］.Science，1997，275(5308):1943-1947.

［10］Steck P A，Pershouse M A，Jasser S A，et al.Identification of a candidate tumour suppressor gene，MMAC1，at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers［J］.Nat Genet，1997，15(4):356-362.

［11］Schmitz M，Grignard G，Margue C，et al.Complete loss of PTEN expression as a possible early prognostic marker for prostate cancer metastasis［J］.Int J Cancer，2007，120(6):1284-1292.

［12］陳剛，林色南，胡丹，等.COX-2和VEGF在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義［J］.診斷病理學(xué)雜志，2007，14(6):453-455.

［13］張華東，熊正文，黃勇，等.血管內(nèi)皮生長因子mRNA及其蛋白、上皮細胞鈣黏蛋白在喉鱗狀細胞癌中表達的研究［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2011，23(3):1-5，110.