張景燕 陳 娟 王 蓉 趙靜姝 吳燕川

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能損害和記憶力減退為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口老齡化不斷加劇，AD的發(fā)病率和患病率逐年增加，研究如何防治AD、降低發(fā)病率勢(shì)在必行［1］。Piazza等［2］認(rèn)為機(jī)體內(nèi)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)增高可致神經(jīng)細(xì)胞毒性，是誘發(fā)AD的因素之一，而Hcy是含硫的氨基酸，需要通過(guò)人體必需氨基酸甲硫氨酸(Hcy的唯一前體)代謝脫去甲基后形成。體內(nèi)Hcy濃度受到各種因素的影響，最常見(jiàn)的如飲食中葉酸和維生素B12缺乏，即可引起Hcy濃度增高，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生［3］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察葉酸和維生素B12對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的影響，探討葉酸和維生素B12對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1)細(xì)胞株:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

2)試劑:葉酸和維生素B12系SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品。MTT〔噻唑藍(lán)，3-(4，5-dimethylthyl thiazo-l 2-yl)-2，5diphenyltetrazolium broide〕系 Sigma公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)系北京亞太精細(xì)化工公司產(chǎn)品。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑系北京森美?？翟噭┕井a(chǎn)品。

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d傳代1次，中間換液1次。

2)MTT代謝率測(cè)定:將生長(zhǎng)良好、傳代穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板(Nunc產(chǎn)品)，每孔體積200 μL，48 h后分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。包括:對(duì)照組、葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組，各組細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)液體積均相等，于接種后第3天，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 200 μL，振搖 10 min，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(multiskan spectrum)測(cè)定550 nm處吸光度值(A)。

3)LDH漏出率測(cè)定:將SY5Y細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測(cè)定)。于接種后第3天留取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用日立7170生化分析儀進(jìn)行酶法測(cè)定。

4)細(xì)胞計(jì)數(shù):將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測(cè)定)。于接種后3 d對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

5)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察:倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測(cè)定

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組可使SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率升高，線粒體活性增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率的影響Tab.1 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the metabolic rate in SH-SY5Y

2.2 LDH漏出率測(cè)定

用酶法測(cè)定的LDH漏出率結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率降低，說(shuō)明細(xì)胞死亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

表2 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響Tab.2 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the LDH leakage rate in SH-SY5Y

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，SH-SY5Y細(xì)胞中分別加入葉酸、維生素B12以及葉酸和維生素B12共同作用后，細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

表3 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Tab.3 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the cell count in SH-SY5Y

3 討論

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是B族維生素，由喋啶核、對(duì)氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成，人體不能自行合成，葉酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成葉酸的活性型四氫葉酸。維生素B12也屬B族維生素，在葉酸的代謝中必不可少，并且都是同型半胱氨酸(Hcy)合成蛋氨酸的輔酶。葉酸能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，在調(diào)控神經(jīng)生成和程序性細(xì)胞死亡中起重要作用。

由于機(jī)體內(nèi)Hcy濃度與葉酸和維生素B12的水平呈負(fù)相關(guān)［4-5］，當(dāng)葉酸和維生素B12在體內(nèi)的水平降低時(shí)，Hcy濃度增高，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA損傷，從而增加老年性癡呆患病的風(fēng)險(xiǎn)。老年人的日常飲食攝入量較少，可能造成各種營(yíng)養(yǎng)包括葉酸和維生素B12的缺乏［6-7］，從而影響Hcy的代謝轉(zhuǎn)化，如果能夠及時(shí)的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，尤其是B族維生素(葉酸和維生素B12)可以加強(qiáng)Hcy的代謝，降低血Hcy的含量［8-13］，減緩老年人認(rèn)知功能的減退，對(duì)預(yù)防AD起到積極防治作用，同時(shí)，補(bǔ)充葉酸、維生素B12簡(jiǎn)單易行，能夠讓老年群體接收。本實(shí)驗(yàn)證明，葉酸、維生素B12對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞確實(shí)存在保護(hù)作用，尤其是二者合用效果更為明顯，能夠增加細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，減少細(xì)胞死亡，此結(jié)果為通過(guò)補(bǔ)充葉酸、維生素B12保護(hù)神經(jīng)元、預(yù)防AD提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本研究通過(guò)觀察葉酸、維生素B12對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的作用，從細(xì)胞水平上研究了葉酸、維生素B12對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)于臨床上防治AD具有參考意義。

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