閆 峰 劉向榮 趙海蘋 王榮亮 吉訓(xùn)明 羅 玫 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

缺血性腦血管病在腦血管病中占絕大多數(shù)，對于缺血性腦血管病的保護(hù)研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。近來有研究［1-2］報道，基于保護(hù)缺血心肌免受再灌注損傷的預(yù)適應(yīng)所產(chǎn)生的遠(yuǎn)隔后適應(yīng)可以通過一定方式有效保護(hù)卒中腦組織，這種保護(hù)是在中風(fēng)即刻或再灌注即刻給予一次后適應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)是在此基礎(chǔ)上，觀察遠(yuǎn)隔后適應(yīng)的長期應(yīng)用是否與神經(jīng)中絲(NF)表達(dá)有關(guān)。NF是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和軸突細(xì)胞骨架及維持細(xì)胞形態(tài)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，可反映神經(jīng)元功能及軸突再生情況。有研究［3］表明，NF200在脊髓損傷中起到修復(fù)神經(jīng)元的作用，但其對缺血性腦損傷的影響鮮有報道。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量280～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司〔動物許可證號:SCXK(京)2012-0001〕。飼養(yǎng)于SPF級動物室，自由進(jìn)食進(jìn)水。大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為4組:①缺血再灌注7 d組(C7，n=6);② 缺血再灌注后適應(yīng)7 d組(P7，n=6);③ 缺血再灌注 28 d 組(C28，n=6);④缺血再灌注后適應(yīng)28 d組(P28，n=6)。

1.2 儀器

小動物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，DEVEL，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、血?dú)夥治鰞x(美國，ABBOTT，i-STAT)、多導(dǎo)生理記錄儀 (biopac mp100)、激光多普勒血流儀(PERIMED，PeriFlux System 5000)，顯微手術(shù)器械。

1.3 動物模型制作

采用改良的Zea Longa法［4］制備大鼠腦缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠稱體質(zhì)量后5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2誘導(dǎo)麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2維持麻醉。頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，使用頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，至距頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處約2 cm，缺血時間為2 h。使用反饋式控溫毯監(jiān)測大鼠肛溫，將大鼠體溫保持于36.5℃ ～37.5℃。分離大鼠尾動脈插入PE-50管持續(xù)監(jiān)測血壓，每半小時測一次血?dú)?pH，PO2，PCO2)。術(shù)中使用激光多普勒監(jiān)測腦血流以確保模型的成功。

1.4 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)方法

動物吸入麻醉后使用橡皮止血帶阻斷動物雙下肢血流，分別于再灌注即刻及實(shí)驗(yàn)周期中每天進(jìn)行1次，每次阻斷10 min，開放10 min，循環(huán)3次。對照組每次麻醉但不阻斷血流。

1.5 Western blotting

每組留取3只大鼠，在缺血再灌注第7天和第28天處死大鼠，留取缺血側(cè)皮質(zhì)腦組織。提取皮質(zhì)腦組織蛋白、測定蛋白濃度:腦組織于冰上加入裂解液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，冰浴30 min，使用4℃離心機(jī)12 000 r/min，離心30 min，取上清。根據(jù)BCA法參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，于560 nm處測定樣本的吸光度值(A值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計(jì)算各樣本的蛋白含量。配制8%分離膠和5%積層膠，取60 μg蛋白樣品溶于相應(yīng)體積的上樣液中，水浴鍋95℃ ～100℃加熱5 min蛋白變性后即刻加樣。室溫下80 V電泳1 h，蛋白樣品到達(dá)分離膠后將電壓調(diào)為100 V，繼續(xù)電泳約1.5 h。配制電轉(zhuǎn)液，4℃下以90 V 120 min的條件下轉(zhuǎn)至預(yù)先用甲醇處理好的NC膜上。將膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，置入5%脫脂牛奶中封閉2 h。置入一抗中4℃孵育過夜，次日去掉一抗，TBST清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室溫孵育1 h。抗體做如下稀釋:NF200抗體(1∶1 000，Abcam公司)、β-actin抗體(1∶2 000)、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶2 000)。化學(xué)發(fā)光法檢測條帶。AlphaE-aseFC軟件分析蛋白條帶的相對吸光度。

1.6 免疫熒光染色

每組留取3只大鼠，分別在缺血再灌注第7天和第28天處死大鼠，在大鼠腦模具中以視交叉開始冠狀位向前及后各留取2 mm厚的腦組織，石蠟包埋，切片，進(jìn)行免疫熒光染色。步驟如下:腦組織切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，H2O2/甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復(fù)12 min，小牛血清封閉非特異性抗原1 h;滴加NF200抗體(1∶1 000，Abcam公司);加TRITC山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min;PBS漂洗3次，每次3 min;DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各數(shù)據(jù)組間比較使用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對大鼠腦缺血NF200含量的影響

如圖1所示，P7組大鼠腦組織內(nèi)NF200表達(dá)比C7組顯著增高(P＜0.05);P28組大鼠腦組織內(nèi)NF200表達(dá)比C28組及P7組顯著增高(P均＜0.05);C28組大鼠與C7組大鼠比較，腦組織內(nèi)NF200表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。圖2為長期遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對大鼠腦缺血后腦組織NF200含量影響的定量分析結(jié)果。

2.2 大鼠腦缺血NF200蛋白表達(dá)免疫熒光結(jié)果

為進(jìn)一步探討NF200蛋白表達(dá)的部位，我們應(yīng)用免疫熒光染色對NF200/DAPI(代表神經(jīng)元細(xì)胞核)進(jìn)行了染色，發(fā)現(xiàn)缺血損傷后NF200在神經(jīng)元及軸突中均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組的陽性染色神經(jīng)元及軸突較對照組明顯增加，28天后適應(yīng)組的陽性染色神經(jīng)元及軸突較7天后適應(yīng)組的亦明顯增加，箭頭所指為陽性染色的神經(jīng)元(圖3)。

3 討論

NF是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，特異性的分布于神經(jīng)元的胞體及突起內(nèi)，在胞體內(nèi)多交叉成網(wǎng)。NF根據(jù)相對分子質(zhì)量的不同可分為 NF68、NF160和NF200 3種，其中NF200在正常情況下只存在于軸索中，而胞體不含或很少含有，故正常情況下神經(jīng)元胞體NF200染色為陰性。腦組織受到損傷時，損傷區(qū)域鄰近的神經(jīng)元在創(chuàng)傷刺激及多種誘導(dǎo)因子的作用下，開始大量合成及積存NF200，以適應(yīng)軸突再生的需要，NF200積存于胞體內(nèi)而使胞體著色，因此NF200是指示軸突再生狀況的一個間接指標(biāo)［5-7］。

NF200在脊髓損傷中的研究較缺血腦損傷中更為深入，有文獻(xiàn)［8］報道，脊髓損傷后由于很多成熟的神經(jīng)元在軸突損傷后并沒有死亡，而再生過程中軸突并無合成蛋白的能力，恢復(fù)中的神經(jīng)元胞體不斷合成新的蛋白質(zhì)及其他產(chǎn)物輸向軸突，這些結(jié)構(gòu)是神經(jīng)再生的基礎(chǔ)，在維護(hù)神經(jīng)元的功能和軸漿的轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮著重要作用。有研究［9］表明，脊髓損傷后NF200的陽性表達(dá)程度與神經(jīng)功能恢復(fù)有著密切的聯(lián)系。

以往認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞一旦受到損傷則無再生能力，但目前研究［10-11］認(rèn)為未成熟腦細(xì)胞的可塑性較強(qiáng)，如Kim等［10］發(fā)現(xiàn)只要給予受損神經(jīng)細(xì)胞以適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)生長因子環(huán)境，受損的神經(jīng)細(xì)胞可以再生。之前有研究［12］報道遠(yuǎn)隔后適應(yīng)可以增加神經(jīng)生長因子等一些相關(guān)蛋白表達(dá)，起到減少缺血造成腦損傷程度的作用。NF200作為神經(jīng)中間絲，是缺血損傷后神經(jīng)軸突出芽和再生的重要標(biāo)志，其表達(dá)對細(xì)胞骨骼蛋白在細(xì)胞正常形態(tài)、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等方面具有至關(guān)重要的作用［13］。

根據(jù)NF200在脊髓損傷前后變化的特性，本實(shí)驗(yàn)觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后NF200的變化情況，并且觀察了大腦中動脈缺血后長時間給予多次肢體遠(yuǎn)端后適應(yīng)腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)NF200的變化，發(fā)現(xiàn)了與脊髓損傷中相似的情況，即陽染的神經(jīng)元在損傷區(qū)周邊神經(jīng)細(xì)胞胞體及軸突內(nèi)均有分布。根據(jù)NF200在神經(jīng)細(xì)胞胞體及軸突中作為細(xì)胞骨架的重要成分，我們可以推測腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元具有自發(fā)的軸突再生的潛力，而遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)7天組相對于單純?nèi)毖?天組，遠(yuǎn)隔后適應(yīng)28天組相對于單純?nèi)毖?8天組NF200表達(dá)均有明顯的增加，說明長時間多次的遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)有利于損傷的神經(jīng)纖維再生，而且后適應(yīng)28天組相對于后適應(yīng)7天組NF200的表達(dá)又有明顯的增加，更說明了長期給予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)可持續(xù)的促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，對神經(jīng)功能的恢復(fù)有更加積極的作用。

圖3 免疫熒光染色檢測腦缺血大鼠腦組織NF200蛋白的表達(dá)及長期遠(yuǎn)隔后適應(yīng)的作用Fig.3 Immunofluorescence staining of NF200 in the brain of rats following cerebral ischemia and the effect of remote ischemic post-conditioning in long term(200×)

研究遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)的機(jī)制可以幫助我們更好的找到腦缺血時機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)提示我們長期多次的給予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)確實(shí)可以對機(jī)體產(chǎn)生積極的作用。

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