唐宇龍 ，何流琴 ，2，C.M.NYACHOTI，印遇龍

（1．中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，湖南長沙，410125；2.中國科學(xué)院研究生院，北京100039；3.Department of Animal Science,University of Manitoba,Winnipeg,Manitoba,Canada.R3T 2N2）

生豬健康養(yǎng)殖關(guān)乎國計(jì)民生，豬腸道功能的研究對提高營養(yǎng)的利用率、降低氮排放和增強(qiáng)豬的抵抗力具有重要意義[1，2]。目前，研究腸道功能的方法技術(shù)有多種，基本分為在體、離體和體內(nèi)等幾種方法。由于豬腸粘膜具有高代謝與絨毛微血管結(jié)構(gòu)的特性，對灌注不敏感，所以本實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)介紹在體的小腸灌注技術(shù)和離體的尤斯灌流(Ussing chamber)技術(shù)在豬腸道功能研究方面的應(yīng)用。小腸灌注技術(shù)是通過建立仔豬的原位模型[3]，在病原菌的感染下研究益生素、益生菌或其他添加劑防治仔豬腸道腹瀉的效果。尤斯灌流技術(shù)是用微電極檢測整個(gè)細(xì)胞膜離子通道變化的電流信號(hào)，反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化[4]。因此，本文就這兩種技術(shù)的操作、應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 小腸灌注和尤斯灌流技術(shù)

1.1 小腸灌注技術(shù)及小腸灌注手術(shù)對腸道感染的應(yīng)用

1.1.1 小腸灌注技術(shù) 為了控制仔豬的腸道腹瀉，Nabuurs建立了原位小腸灌注技術(shù)[5]，該方法通過檢測小腸的凈流量和電解質(zhì)濃度來鑒定不同物質(zhì)在腹瀉上的作用。我們實(shí)驗(yàn)室在加拿大Dr.C.M.NYACHOTI的幫助下，把6mg/kg劑量給予鹽酸氯氨酮肌肉注射。在15min-30min后，動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)，迅速用熱肥皂水清洗試驗(yàn)動(dòng)物，然后將試驗(yàn)動(dòng)物側(cè)位置于手術(shù)臺(tái)上（左側(cè)朝下，右側(cè)朝上），加上呼吸面罩，開始使用氣體麻醉。

先用毛剪剃除術(shù)部毛發(fā)，再用熱肥皂水洗出術(shù)部皮脂。以碘酊棉球在術(shù)部中心位置開始作發(fā)散狀螺旋涂抹消毒。稍后用75%酒精棉球如上述同樣方法脫碘。蓋好手術(shù)孔巾。手術(shù)者事先嚴(yán)格洗手、消毒，穿戴好手術(shù)衣帽、手套。等待動(dòng)物進(jìn)入麻醉期Ⅲ期2級，方可開始手術(shù)。

在腹腔處用手術(shù)刀作12cm-15cm的縱向切口，依次鈍性分離腹外斜肌、橫直肌和腹內(nèi)斜肌。到底腹膜層后，由手術(shù)者和助手用止血鉗對夾，提起腹膜，使腹膜與內(nèi)臟分離。用手術(shù)剪將腹膜剪開3cm左右小口，然后術(shù)者左手食指與中指探入腹腔內(nèi)抬起腹膜，手術(shù)剪在兩指間剪開腹膜，開口大小與皮膚口大小相當(dāng)。

先找到胃的幽門部，在離幽門部的300cm處用手術(shù)線做成標(biāo)記。線的前一端固定在離幽門部的300cm,另一端順著小腸取出余下空腸，不要破壞腸系膜。在距幽門300cm處剪取20cm-25cm的空腸，上端插入內(nèi)徑3mm，外徑5mm的皮管，皮管上端連接所需要檢測樣品的玻璃瓶；下端插入內(nèi)徑5mm，外徑9mm的皮管，皮管下端連接著玻璃瓶收集由上端流出的液體。在仔豬的空腸部位可以建立十個(gè)同樣的空腸手術(shù)段。

1.1.2 小腸灌注手術(shù)對腸道感染的應(yīng)用 根據(jù)在空腸部位建立的空腸手術(shù)片段（圖1）分成感染組和非感染組，感染組以濃度108 cfu/mL的病原菌灌注在空腸內(nèi)，感染15min。非感染組灌注PBS作為對照。感染后待測樣品用60mL去離子水溶解到所需濃度，同時(shí)加入1 g/L的葡萄糖和酪蛋白氨基酸以促進(jìn)細(xì)菌生長。在試驗(yàn)過程中，60mL的待測樣品用注射器緩慢的從皮管上端推進(jìn)到空腸，速度控制在8mL/h。整個(gè)試驗(yàn)過程控制在7.5h。試驗(yàn)結(jié)果可通過測定流入和流出液體中鈉離子和氯離子的濃度來確定樣品對滲透壓影響；測定流出液體的總量來研究樣品對凈吸收量的作用；鑒定病原菌的濃度判斷樣品對病原微生物的抑制能力。

圖1 小腸灌注技術(shù)示意圖

1.2 尤斯灌流技術(shù)的結(jié)構(gòu)和原理

1.2.1 尤斯灌流技術(shù)的結(jié)構(gòu) 尤斯灌流系統(tǒng)主要由灌流室、電路系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)以及配套系統(tǒng)組成。常見的灌流室有2、4、6和8室4種類型[6]。根據(jù)工藝不同，又分為循環(huán)式和持續(xù)式，本實(shí)驗(yàn)室擁有循環(huán)式儀器，如圖2。循環(huán)式灌流室包括1個(gè)U形管道和2個(gè)半室，2個(gè)半室中間是1個(gè)可嵌合組織樣本且可移動(dòng)的插件。持續(xù)式灌流室包括2個(gè)溶液貯器，通過聚乙烯管道將溶液引入2個(gè)半室，并設(shè)閥門控制流速。電路系統(tǒng)（圖3）包括用于測量跨上皮電壓和電流電極、與電壓/電流鉗相連的導(dǎo)線以及電壓/電流鉗。電壓/電流鉗由靈敏的首級信號(hào)采集片、電流和流體阻抗補(bǔ)償范圍、用于電導(dǎo)/電阻測量的脈沖發(fā)生器、可通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)采集的遠(yuǎn)程接口以及LED讀數(shù)顯示器組成。

圖2 循環(huán)式尤斯灌流系統(tǒng)示意圖

圖3 循環(huán)式尤斯灌流電路系統(tǒng)示意圖

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)是一套綜合的數(shù)據(jù)采集與分析軟件包，由數(shù)據(jù)采集硬件、接口電纜及ACQUI R E和ANAL YZE(A&AⅡ)軟件包組成。A&AⅡ在Windows環(huán)境下運(yùn)行，可測量電流、電壓、電導(dǎo)及阻抗，可同時(shí)對1-8個(gè)組織進(jìn)行測量。還包括縮放控制、試驗(yàn)協(xié)議、事件標(biāo)記、數(shù)據(jù)析取工具及快速數(shù)據(jù)匯總工具等其他功能。

配套系統(tǒng)包括恒溫水浴箱、5%CO2+95%O2混合氣體循環(huán)系統(tǒng)和注射器等。恒溫水浴箱的技術(shù)參數(shù)：功耗為1 kW，水泵流速為6L/min，恒溫波動(dòng)小于0.5℃。

1.2.2 尤斯灌流技術(shù)的基本原理 尤斯灌流系統(tǒng)的基本功能是進(jìn)行上皮細(xì)胞膜離子泵功能和抗?jié)B阻抗測定。上皮組織由密集排列的上皮細(xì)胞和少量細(xì)胞間質(zhì)組成，具有極性和緊密連接這兩大區(qū)別于其他組織的特征。極性是因?yàn)榧?xì)胞游離面（或頂面）和基底面結(jié)構(gòu)和功能的分布不均造成的；而緊密連接又稱閉鎖小帶，常見于單層柱狀上皮和單層立方上皮中，位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面，緊密連接除具機(jī)械連接作用外，更重要的是封閉細(xì)胞間隙，阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)。上皮細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)逆著離子濃度梯度將離子從膜的一側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)向另一側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)過程中產(chǎn)生跨膜電勢，被稱為Vt。產(chǎn)生Vt的前提是上皮細(xì)胞膜頂側(cè)和基底側(cè)離子的分布是非均勻的。細(xì)胞膜頂側(cè)電勢（Va）和基底側(cè)電勢（Vb）之差即為Vt。通過對上皮細(xì)胞電流鉗可完成Vt的測定，這就是通常所說的斷路記錄，在研究上皮物質(zhì)的吸收以及分泌機(jī)制方面極為有用。

1.2.3 尤斯灌流系統(tǒng)的具體操作步驟 使用尤斯灌流之前首先進(jìn)行緩沖液、試驗(yàn)用溶液的配制，同時(shí)制備好電流電極和電壓電極，電極制備過程中注意兩點(diǎn)：一是電極制備應(yīng)在3%瓊脂糖溶液冷卻之前；二是電極中避免氣泡的存在，若有氣泡應(yīng)用注射器回吸。在固定上皮組織和加入緩沖液之前，將尤斯灌流系統(tǒng)各個(gè)部件安裝好，檢測系統(tǒng)是否滲水。接著插入電極，電極電阻會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，進(jìn)而導(dǎo)致電極電阻的不對稱性。因此，試驗(yàn)開始前應(yīng)檢測系統(tǒng)噪聲以及補(bǔ)償電壓。目前，多數(shù)尤斯灌流系統(tǒng)都能補(bǔ)償溶液阻抗以及電極電壓。然后固定好上皮組織以及加入緩沖液，開始電參數(shù)記錄。上皮組織由于受機(jī)械壓迫導(dǎo)致電參數(shù)(Vt、Isc和Rt)極不穩(wěn)定，需要10min-30 min的時(shí)間讓電參數(shù)基線穩(wěn)定下來。一旦電參數(shù)基線穩(wěn)定下來即可開始目的試驗(yàn)，具體操作程序可參考何流琴等方法[7]。

2 小腸灌注和尤斯灌流室技術(shù)在腸道研究中的應(yīng)用

2.1 小腸灌注技術(shù)在腸道研究上的應(yīng)用

斷奶仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)最主要的危害之一，該病嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，讓其遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，控制仔豬腹瀉的方法已經(jīng)從添加抗生素轉(zhuǎn)到研究其新的替代物上，已有的研究主要包括益生元、益生菌、卵黃抗體、天然植物、中草藥提取物等[8]。小腸灌注技術(shù)的應(yīng)用將加快該研究的速度，降低其研究的成本和加強(qiáng)對其作用機(jī)制研究的深入。

Kiarie在2008年為了驗(yàn)證反丁烯二酸(fumaric acid)、氧化鋅(zinc oxide)、卵黃抗體(egg yolk antibodies)和卡巴多司(carbadox)的抗腹瀉效果[9]，以小腸灌注技術(shù)為基礎(chǔ)，以腸毒性大腸桿菌為感染源研究了以上物質(zhì)在空腸中與病原菌的相互作用。其結(jié)果證明了PBS對照組與四種不同的添加劑相比，其凈流量更高，電解質(zhì)損失也更大。推斷了四種物質(zhì)均具有抗腹瀉的作用。

四種物質(zhì)的相互比較顯示：凈流量最高的為丁烯二酸，其次是氧化鋅和卡巴多司，卵黃抗體的效果最佳；電解質(zhì)的損失情況與凈流量結(jié)果相似。上述物質(zhì)也進(jìn)一步在動(dòng)物試驗(yàn)中證明了具有抗腹瀉和抑制病原菌生長的功能。因此原位小腸灌注技術(shù)模型能作為一個(gè)評估添加劑的技術(shù)平臺(tái)，研究其抗生素替代物，包括益生元、益生菌、天然植物、卵黃抗體等在抵抗仔豬腹瀉中的作用，為生豬健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

2.2 尤斯灌流技術(shù)在研究腸道功能上的應(yīng)用

利用尤斯灌流技術(shù)在動(dòng)物營養(yǎng)與生理中應(yīng)用主要集中在胃腸道屏障功能以及胃腸粘膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面。而胃腸道功能主要集中在胃腸道上皮通透性、內(nèi)毒素及細(xì)菌移位的途徑和機(jī)制以及谷氨酰胺(Gln)和益生菌對腸道屏障功能的改善等方面。并且尤斯灌流技術(shù)為研究胃腸道物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)效率提供了快捷且有效的途徑，研究主要集中在葡萄糖、氨基酸以及礦物元素等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方面。而本實(shí)驗(yàn)室目前應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)主要研究了賴氨酸、葡萄糖、谷氨酸等物質(zhì)在腸粘膜中的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。我們實(shí)驗(yàn)室采用16只SD雌性大鼠隨機(jī)分成兩組，一組飼喂玉米醇溶蛋白日糧，一組飼喂常規(guī)日糧作為對照組。21d后采取大鼠空腸和回腸黏膜，應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)測定賴氨酸的腸道通透轉(zhuǎn)運(yùn)效率。其中試驗(yàn)中為了提高準(zhǔn)確性，以甘露醇作為空白對照。當(dāng)添加1m l含10000μg的Ly s溶液于擴(kuò)散池，轉(zhuǎn)運(yùn)60mi n后，試驗(yàn)組與對照組比較，空腸和回腸擴(kuò)散池內(nèi)Lys含量變化差異極顯著（P=0.003和P=0.001），而接收室內(nèi)Ly s含量變化差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)與對照組相比，試驗(yàn)組擴(kuò)散池內(nèi)空腸和回腸Lys含量分別低13.60%和15.29%，盡管接收室內(nèi)Lys含量未受影響，但試驗(yàn)組中L y s由擴(kuò)散池經(jīng)空腸或回腸向接收室的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所消耗的Lys有顯著變化(P=0.006或P=0.001)，分別使Lys消耗量增加28.06%或51.74%。試驗(yàn)組空腸和回腸Lys損耗率分別為46.55%和51.28%，而對照組空腸和回腸Lys損耗率分別為36.34%和33.79%。由此可表明在不同日糧間對腸粘膜Lys透過量有顯著影響。同時(shí)何流琴等研究[7]還發(fā)現(xiàn)日糧缺乏Lys對腸道其他AA通透量也有影響。在轉(zhuǎn)運(yùn)液中除Lys出現(xiàn)在尤斯灌流系統(tǒng)的擴(kuò)散池和接收室以外，還發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)散池和接收室內(nèi)均測出一些其他AA，即 Arg、His、Thr、Asp、Glu、Ser和 Gly，并且其在空腸和回腸中個(gè)別氨基酸有升高或者降低的趨勢。但是目前日糧缺乏Lys對其他氨基酸影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。并且由于尤斯灌流技術(shù)在我國營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域研究甚少，技術(shù)分析不成熟，其技術(shù)原理仍需進(jìn)一步探討。

另外本研究組伍力、何流琴[7]等人運(yùn)用尤斯灌流技術(shù)研究了功能性氨基酸對嘔吐毒素應(yīng)激造成的腸道損傷的緩解作用。該實(shí)驗(yàn)采用了五種不同日糧飼喂動(dòng)物，對照組飼喂普通日糧，攻毒組仔豬日糧中添加了6ppm的嘔吐毒素，剩余三組仔豬的日糧中分別添加了1%Arg，1%Gln以及精氨酸和谷氨酰胺各0.5%。三個(gè)功能性氨基酸組的仔豬提前進(jìn)行了免疫強(qiáng)化三周后再進(jìn)行攻毒，經(jīng)尤斯灌流技術(shù)測定其腸粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。以考察功能性氨基酸對嘔吐毒素應(yīng)激的緩解作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嘔吐毒素顯著抑制了葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，而功能性氨基酸在一定程度上能夠緩解嘔吐毒素對葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率

3 小腸灌注和尤斯灌流技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

3.1 小腸灌注技術(shù)對宿主和益生菌的應(yīng)用

小腸灌注技術(shù)除了研究小腸對腹瀉的生理反應(yīng)之外，還可以通過提取小腸粘膜樣本研究宿主基因組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，分析了相關(guān)上調(diào)的基因。在益生菌的研究方向，Gross[10]通過小腸灌注技術(shù)研究了胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的親本菌株和Mannose-specific adhesin突變菌株對小腸粘膜的粘附和富集影響，在8h的作用下，胚牙乳桿菌Mannose-specific adhesin基因的缺失將會(huì)部分失去對腸上皮細(xì)胞粘附和富集的能力，導(dǎo)致在感染情況下該凈流量的提高，腹瀉幾率的上升。因此以小腸灌注技術(shù)為基礎(chǔ)的試驗(yàn)可證明益生菌相關(guān)基因的功能，這將會(huì)為研究益生菌的改造從而提供機(jī)體抵抗力提供重要的理論基礎(chǔ)。

由此可知，原位的小腸灌注技術(shù)模型不但能快速評估和研究不同抗生素替代品對抵抗腹瀉的作用，而且對于宿主抵抗腹瀉機(jī)制的研究和益生菌改造提供重要的技術(shù)支持。

3.2 尤斯灌流技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

利用尤斯灌流系統(tǒng)研究腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝的基礎(chǔ)主要是根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)可以在腸段特定的位置吸收和通過，測定該特定腸段的營養(yǎng)物質(zhì)含量，通過有效滲透系數(shù)來評價(jià)該藥物吸收的動(dòng)力學(xué)變化。尤斯灌流技術(shù)已經(jīng)在畜禽營養(yǎng)與藥物生理學(xué)研究領(lǐng)域逐漸成熟，尤其在胃腸道屏障功能及藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域得到應(yīng)用。但關(guān)于尤斯灌流很少涉及細(xì)胞學(xué)研究，特別是對細(xì)胞內(nèi)藥物吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。目前藥物在腸道內(nèi)吸收的研究方法有離體、在體、體內(nèi)等幾種方法。據(jù)證實(shí)Caco-2單層細(xì)胞一般認(rèn)為是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究的一種合適的體外模型，因?yàn)檫@些單層細(xì)胞具有小腸黏膜的大多數(shù)酶、功能和形態(tài)學(xué)特征[11]。但是應(yīng)用該模型研究藥物的吸收情況與體內(nèi)的差異性較大。而尤斯灌流技術(shù)為解決這個(gè)問題提供了新思路，為細(xì)胞學(xué)研究提供了新方法[12]。

尤斯灌流系統(tǒng)的研究對象為上皮組織，而上皮組織廣泛分布在身體表面和體內(nèi)各種囊、管、腔的內(nèi)表面。上皮組織具有保護(hù)、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差異。如分布在身體表面的上皮以保護(hù)功能為主；體內(nèi)各管腔面的上皮，除具有保護(hù)功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮組織，從表面生長到深部結(jié)締組織中去，分化成為具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究對象可擴(kuò)展到機(jī)體任意上皮組織。就某一具體上皮組織而言，可研究的內(nèi)容也多樣化，從藥物篩選到屏障功能、免疫功能、物質(zhì)吸收與代謝及分泌和排泄等。

4 小結(jié)

小腸灌注和尤斯灌流室技術(shù)的應(yīng)用是相輔相成的，他們主要都是以腸道作為研究對象，研究其益生物質(zhì)對腸道的營養(yǎng)吸收和抵抗病原侵襲等方面。小腸灌注技術(shù)是以原位的活體形式宏觀的研究腸道的生理變化；尤斯灌流室技術(shù)則是通過離體培養(yǎng)形式研究腸道的微觀分子變化?？傊@兩種技術(shù)的應(yīng)用將為益生物質(zhì)在腸道的健康上提供重要的技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

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