徐偉麗，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090哈爾濱)

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已成功用于物種鑒別，其中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)更是廣泛應(yīng)用于食品原料物種鑒別、飼料中動物源性成分的鑒別和摻偽檢驗.核酸分子是PCR技術(shù)應(yīng)用的主要對象，所以，DNA的分離與提取是該項技術(shù)的重要前提［1-4］.反芻動物奶中含有體細(xì)胞(包括白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞).有研究表明，這些細(xì)胞可以作為DNA來源用于PCR擴增特定靶序列的區(qū)別動物物種［5-9］.目前，對于植物和動物組織全基因組DNA的提取方法已有不少研究和報道［10-19］.奶粉不同于一般的植物和動物組織材料，適宜的提取方法也不同.能夠更有效地提取更高質(zhì)量的奶粉基因組DNA方法的篩選，是一個需要進一步探討的問題.

目前關(guān)于奶粉中全基因DNA的提取國外尚無報道，國內(nèi)僅有岳巧云等［20］采用 Plant DNA Wizard純化試劑盒(Promega公司)提取奶粉中的基因組DNA用于實時熒光PCR法對奶粉中的豆粉進行檢測.此方法具有費用高、費時、對操作技能有較高要求等缺點，因此，需要發(fā)展簡單、快速、成本低的奶粉基因組DNA提取方法.而采用不同方法提取奶粉基因組DNA的比較研究目前國內(nèi)外尚無報道.本實驗選擇熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB(cetyl-trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸鈉)法和高鹽低pH值法、異硫氰酸胍法6種方法，以市售奶粉為材料，進行基因組DNA提取，通過提取效果比較，探討適用于奶粉的基因組DNA提取方法.為乳品安全中利用PCR技術(shù)進行快速檢測找到簡單、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法.

1 實驗

1.1 實驗材料

全脂奶粉購于超市，于陰涼干燥處儲存?zhèn)溆?開封后分裝，于4℃保存.

1.2 試劑

Tris Base、EDTANa2、SDS、CTAB、異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris平衡酚、瓊脂糖 G-10、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇及PCR試劑均購于哈爾濱寶泰克生物科技有限公司.

1.3 主要儀器

TGL-16G型臺式離心機、DK-80型電熱恒溫水槽、WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計、DYY-10型(ECP3000)三恒電泳儀、TAKARA TP600 PCR儀、Bio-RAD Universal HoodⅡ凝膠成像儀和電腦750 W微波爐均為本實驗室儀器.

1.4 引物

參照文獻［21］合成擴增牛12SrRNA基因設(shè)計特異性引物cow-1:5'-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-CGATAA-3';cow-2:5'-AAATAGGGTTAGATGCACT-GAATCTAT-3'，擴增產(chǎn)物 344 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.5 DNA提取方法

熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、異硫氰酸胍法的具體步驟見文獻［1，3］.

1.6 基因組DNA純度和質(zhì)量濃度檢測

［1，3］進行檢測.根據(jù)ρ(DNA)/(mg·L-1)=50×D(260nm)×501計算DNA質(zhì)量濃度;根據(jù)D(260nm)/D(280nm)和D(260nm)/D(230nm)判斷DNA的大致純度.

1.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測

5μL 基因組 DNA與1μL6×Loading Buffer混勻，點樣，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)，紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板并拍照.

1.8 基因組DNA用于PCR擴增的適應(yīng)性檢測

參考文獻［1-4］的反應(yīng)體系和條件.用1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

2 實驗結(jié)果

2.1 奶粉基因組DNA質(zhì)量濃度和純度檢測結(jié)果

奶粉中基因組DNA的提取結(jié)果見表1.可以看出:DNA質(zhì)量濃度最大的為SDS法(495.833mg/L);其次為異丙醇沉淀法和熱解法，分別為302.083和231.250mg/L.高鹽低pH法和CTAB法提取的DNA質(zhì)量濃度最低，分別為31.250和29.167 mg/L.提取得到的DNA的D(260nm)/D(280nm)范圍為1.65～1.87，較為理想;若偏高，表明有RNA污染;若偏低，則表明有蛋白或苯酚污染，接近1.80效果最好［22-23］.表中數(shù)據(jù)也表明CTAB法和異丙醇沉淀法提取的基因組DNA的純度較高，其他4種方法均較低.因此，也不能排除由于雜質(zhì)的影響而使DNA質(zhì)量濃度的測量結(jié)果偏大的可能.

表1 奶粉基因組DNA的質(zhì)量濃度和純度

2.2 奶粉基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

奶粉基因組DNA的質(zhì)量濃度和純度進一步采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果見圖1.CTAB法提取的奶粉基因組DNA譜帶單一，無碎片和連片;重復(fù)試驗的DNA條帶遷移率一致，說明此方法具有較好的穩(wěn)定性以及此法提取的基因組DNA完整性好.其他5種方法提取的基因組DNA在凝膠上沒有出現(xiàn)譜帶，其可能原因:一是DNA質(zhì)量濃度較低;二是沒有提取到DNA.

2.3 PCR擴增結(jié)果

奶粉基因組DNA的PCR反應(yīng)結(jié)果見圖2.結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物的量不取決于DNA的質(zhì)量濃度，而是取決于DNA的提取方法.異丙醇沉淀法和SDS法提取的DNA質(zhì)量濃度較高，卻不能得到滿意的PCR擴增產(chǎn)物.其他4種方法提取的基因組DNA樣品的PCR擴增片段大小與預(yù)期一致，且重復(fù)性好.說明這4種方法提取的基因組DNA可以直接用于牛特異性片段的PCR擴增.因此，認(rèn)為這4種方法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.其中熱解法和CTAB法特異性條帶更清晰，效果更好.

圖1 奶粉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 牛特異性引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

PCR技術(shù)以及建立在PCR基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)，能以微觀的視角解釋其他技術(shù)現(xiàn)在無法解決的問題.但是，由于PCR擴增對模板DNA的質(zhì)量要求較高，DNA質(zhì)量是影響分子實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一［1-4，18-19］.

在提取奶粉基因組DNA的過程中要注意:奶粉開封后陰涼干燥處保存，避免雜菌污染和吸濕結(jié)塊;奶粉在進行去蛋白步驟時，顛倒混勻要充分(保持一段時間)，以增加抽提效果;水浴加熱時要使管蓋高出水面并保持一定的高度，避免Eppordorf管炸開，污染樣品.

4 結(jié)論

1)奶粉中的DNA含量很少，這6種方法獲得的提取物中均有蛋白質(zhì)污染.

2)熱解法、CTAB法、高鹽低pH法和異硫氰酸胍法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.綜合考慮基因組DNA的純度和質(zhì)量濃度，認(rèn)為這4種方法的優(yōu)劣依次為:熱解法、異硫氰酸胍法、高鹽低pH法和CTAB法.

3)這4種奶粉基因組DNA提取方法均具有操作簡便、省時、利于快速檢測等優(yōu)點.可以根據(jù)具體的實驗條件和要求選擇相應(yīng)的DNA提取方法.

參考文獻:

［1］徐偉麗，馬鶯，汪家琦，等.大米基因組DNA不同提取方法的比較［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(6):46-49.

［2］徐偉麗，杜明，王文俠，等.熟豆?jié){基因組DNA提取方法的優(yōu)化［J］.2010年國際細(xì)胞生物學(xué)、生物學(xué)、生物工程會議，2010，6:247-251.

［3］徐偉麗，馬鶯，杜明，等.豆粉基因組DNA不同提取方法的比較［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(23):119-122.

［4］徐偉麗，杜明，馬鶯，等.生豆?jié){基因組DNA不同提取方法的比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(20):12013-12015，12017.

［5］LIPKIN E，SHALOM A，KHATIB H，et al.Milk as a source of deoxyribonucleic acid and as a substrate for the polymerase chain reaction［J］.J Dairy Sci，1993，76(7):2025-2032.

［6］AMILLS M，F(xiàn)RANCINO O，JANSA M，et al.Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin［J］.J Dairy Res，1997，64(2):231-238.

［7］MAUDET C，TABERLET P.Detection of cows’milk in goats’cheeses inferred from mitochondrial DNA polymorphism［J］.J Dairy Res，2001，68(2):229-235.

［8］BAI Wenlin，YIN Ronghuan，ZHAO Sujun，et al.Rapid detection of bovine milk in yak milk using a polymerase chain reaction technique［J］.J Dairy Sci，2009，92(4):1354-1360.

［9］ LóPEZ-CALLEJA I，GONZáLEZ I，F(xiàn)AJARDO V，et al.Rapid detection of cows’ milk in sheeps’ and goats’milk by a species-specific polymerase chain reaction technique［J］.J Dairy Sci，2004，87(9):2839-2845.

［10］OARD J H，DRONAVALLI S.Rapid isolation of rice and maize DNA for analysis by random-primer［J］.Plant Mol Biol Rep，1992，10:234-241.

［11］王景雪，孫毅，高武軍.一種簡便實用的植物總DNA提取方法［J］.山西大學(xué)學(xué)報，2000，23(3):271－272.

［12］邵碧英，陳文炳，李壽菘，等.轉(zhuǎn)基因花卉的DNA提取與多重 PCR分析［J］.廈門大學(xué)學(xué)報，2002，41(5):674－678.

［13］彭鎖堂，顏啟傳，王學(xué)德，等.水稻單粒種子DNA提取及RAPD程序優(yōu)化研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2002，20(1):34 －41.

［14］KIM C S.Simple and rapid method for isolation of hign quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP［J］.Nucleic Acid Res，1997，25:1085-1086.

［15］COUCH J A，F(xiàn)RITZ P J.Isolation of DNA from plants high in polyphenolics［J］.Plant Mol Biol Rep，1990，8(1):8-12.

［16］PICH U，SCHUBERT I.Minipreparation method for isolation of DNA from plants with a high content of polyphenolics［J］.Nucleic Acids Research，1993，1(14):3328－3332.

［17］ZIDANI S，F(xiàn)ERCHICHI A，CHAIEB M.Genomic DNA extraction method from pearl millet(Pennisetum glaucum)leaves［J］.African Journal of Biotechnology，2005，4(8):862－866.

［18］BERENDZEN K，SEARLE I，RAVENSCROFT D，et al.A protocol for rapid DNA extraction from arabidopsis thaliana for PCR analysis［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2004，22:49 －52.

［19］沈潔，羅安才.提取蕨類植物 DNA方法比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(4):1738 -1740.

［20］岳巧云，陳定虎，伍朝暉，等.實時熒光PCR在鑒別奶粉中摻入大豆成分的應(yīng)用研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(12):190-193.

［21］LOPEZ-CALLEJA I，GONZALEZ A I，F(xiàn)AJARDO V，et al.PCR detection of cows’milk in water buffalo milkand mozzarella cheese［J］.International Dairy Journal，2005(15):1122 -1129.

［22］王敏強，王斌，劉曉玲.保存溫度與時間對動物組織DNA提取質(zhì)量的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(33):16407-16409.

［23］徐偉麗，杜明，李啟明，等.動物肌肉組織基因組DNA兩種提取方法的比較［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(12):81－84.