王同華,陳衛(wèi)江,李 莓,王建喜,范連益,曲 亮,惠榮奎
(湖南省作物研究所,湖南 長沙 410125)
利用雜種優(yōu)勢是提高油菜生產(chǎn)水平的重要手段。育種實踐表明正確評價自交系間的親緣關系、遺傳差異及性狀互補等方面,對于雜種優(yōu)勢有效利用具有重要意義。但隨著育種材料的頻繁交流、育種方法的不斷創(chuàng)新,導致材料間的系譜關系相互交錯程度大幅度提高,傳統(tǒng)的系譜分析法越來越難以滿足育種材料遺傳多樣性評價的需要。
分子標記的出現(xiàn)為作物育種資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術手段,特別是SSR標記具有數(shù)量豐富、重復性高、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點,已被廣泛應用于作物的品種純度和真實性鑒定、指紋圖譜的繪制及遺傳多樣性分析等研究[1-5]。SSR標記分析具有較高的穩(wěn)定性和可信度,是作物遺傳多樣性分析的首選分子標記之一[6]。筆者以湖南省作物研究所選育的16份甘藍型油菜自交系為材料,通過SSR標記分析評價其遺傳多樣性,以期為油菜種質資源的有效利用提供參考。
供試材料16份,均由湖南省作物研究所選育。其中pol-CMS不育系3份,pol-CMS恢復系11份,溫敏核不育系2份(表1)。
1.2.1 播種與取樣 2011年9月底將16份供試材料播種于湖南省作物研究所試驗田(上季作物為水稻),于苗期(7葉期左右)每份材料摘取5個單株的幼嫩葉片置于2 mL離心管中,-20℃保存。
1.2.2 SSR分析 基因組DNA提取參照Murry等[7]的方法進行,并略有改進。34對SSR引物序列均來自于http://ukcrop.net(表2),由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系與循環(huán)參數(shù)參照陸光遠等[8]報道的方法進行,擴增產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測,并在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察、拍照。
表1 16份供試油菜材料的名稱及來源
1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 根據(jù)SSR電泳圖譜顯示的結果,按照各引物在相同電泳遷移率位置上PCR擴增產(chǎn)物帶的有無進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,其中有帶記為1,無帶記為0,組成1和0的原始矩陣。采用生物學軟件NTSYS-pc2.10e進行數(shù)據(jù)分析,先利用SimQual程序計算材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS),獲得相似系數(shù)矩陣,再用SHAN程序中的UPHMA進行聚類分析,并通過Treeplot模塊生成聚類樹狀圖,并以簡單配對參數(shù)計算基因頻率。按照Nei提出的公式計算SSR位點的多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content,PIC),PIC=1-∑fi2,其中 fi為 i位點的基因頻率[9]。
34對SSR引物在16份供試油菜材料中共產(chǎn)生72條清晰的擴增條帶,平均每對引物產(chǎn)生2.12條。擴增條帶長度在100~650 bp之間,以150~350 bp的片段為主。圖1為引物CB10364和MR049對供試材料的SSR擴增結果,其他引物的擴增效果基本與該引物的擴增效果相當。在34對SSR引物中,28對引物的PCR擴增條帶在供試材料中表現(xiàn)出明顯多態(tài)性,多態(tài)性比例為82.4%。多態(tài)性位點的PIC值在0.12~0.73之間,平均為0.39,其中以引物CB10427的最高(0.73),引物BnGMS633、BnGMS687、Na12-A02、Na12-E09、Na10-D11、Na10-D08的最低,平均為0.12。由此可見,研究選用的SSR引物具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性,也表明供試材料在這些位點存在較高的遺傳變異。
表2 SSR引物序列信息
圖1 引物CB10364和引物MR049對16份供試材料的SSR-PCR擴增
利用生物學軟件NTSYS-pc2.10e對16份供試油菜材料進行聚類分析,結果表明供試的16份材料可以被完全區(qū)分開,各材料間的遺傳相似系數(shù)在0.52~0.90之間,平均為0.63。其中,10個pol-CMS恢復系間的遺傳相似系數(shù)在0.52~0.90之間,平均為0.61;3個pol-CMS不育系間遺傳相似系數(shù)在0.71~0.86之間,平均為0.79;2個溫敏核不育系間的遺傳相似系數(shù)為0.90。如圖2所示,在遺傳相似系數(shù)為0.685時,供試材料可分為A、B、C 3個類群。A類群包含7份材料(5份pol-CMS恢復系、2份溫敏核不育系);B類群包含8份材料(4個pol-CMS不育系、4個pol-CMS恢復系);C類群僅包含1份pol-CMS恢復材料。研究結果表明,在16份供試材料中,pol-CMS恢復系材料間存在較好的遺傳多樣性,pol-CMS不育系材料間的遺傳多樣性相對較差,2份溫敏核不育系材料的遺傳背景非常相近。
研究利用選取的34對SSR引物對16份供試油菜育種材料進行了遺傳分析,結果表明在供試材料中,pol-CMS恢復系材料間具有較好的遺傳多樣性,而pol-CMS不育系材料與溫敏核不育系材料的遺傳多樣性較狹窄。該結果可能與以上育種材料的選育方法密切相關,研究中pol-CMS恢復系大多通過同質恢復系進行選育,即通過已有雜交組合直接自交純合,或利用已有的pol-CMS恢復系材料直接回交轉育,其恢復系材料的遺傳基礎易于拓展,遺傳背景相對廣泛。而pol-CMS不育系的選育主要源于對已有不育系的回交改良,該類型不育系存在不同程度的低溫敏感現(xiàn)象,因此pol-CMS不育系的選育對核心親本的依賴性較強,往往幾個不育系均含一個核心不育系的血緣。另外,研究中溫敏核不育系材料由于受多對隱性基因控制,新型系轉育更為困難,研究供試的2個溫敏核不育系均來源于隱性核不育系86A后代分離群體,有著明顯的遺傳相似性。
對16份供試材料的聚類結果表明,來源于中國農(nóng)業(yè)科學院油料研究所中油雜系列的Z2R、Z8R優(yōu)先聚到一起,來源于隱性核不育系86A的91S、402S優(yōu)先聚到一起,含有SC4的血緣的169A與SC4優(yōu)先聚到一起,通過品質改良17A選育的不育系167A與17A也優(yōu)先聚到一起。這充分說明SSR揭示的遺傳多樣性與地理來源和系譜來源基本一致,可以充分反映材料間的遺傳差異。在該研究中恢復系95-5單獨聚為一類,與其他材料間具有明顯的遺傳特異性,而在表型上該恢復系確實具有土黃色花瓣、種皮自然開裂等非常特殊的農(nóng)藝性狀,需注意對該特異種質資源的保存和利用。由此可見,SSR聚類結果較好地反映了材料間的親緣關系,可為育種資源的有效利用提供參考。
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