王同華，陳衛(wèi)江，李 莓，王建喜，范連益，曲 亮，惠榮奎

（湖南省作物研究所，湖南 長沙 410125）

利用雜種優(yōu)勢是提高油菜生產(chǎn)水平的重要手段。育種實踐表明正確評價自交系間的親緣關系、遺傳差異及性狀互補等方面，對于雜種優(yōu)勢有效利用具有重要意義。但隨著育種材料的頻繁交流、育種方法的不斷創(chuàng)新，導致材料間的系譜關系相互交錯程度大幅度提高，傳統(tǒng)的系譜分析法越來越難以滿足育種材料遺傳多樣性評價的需要。

分子標記的出現(xiàn)為作物育種資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術手段，特別是SSR標記具有數(shù)量豐富、重復性高、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點，已被廣泛應用于作物的品種純度和真實性鑒定、指紋圖譜的繪制及遺傳多樣性分析等研究[1-5]。SSR標記分析具有較高的穩(wěn)定性和可信度，是作物遺傳多樣性分析的首選分子標記之一[6]。筆者以湖南省作物研究所選育的16份甘藍型油菜自交系為材料，通過SSR標記分析評價其遺傳多樣性，以期為油菜種質資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料16份，均由湖南省作物研究所選育。其中pol-CMS不育系3份，pol-CMS恢復系11份，溫敏核不育系2份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 播種與取樣 2011年9月底將16份供試材料播種于湖南省作物研究所試驗田（上季作物為水稻），于苗期（7葉期左右）每份材料摘取5個單株的幼嫩葉片置于2 mL離心管中，-20℃保存。

1.2.2 SSR分析 基因組DNA提取參照Murry等[7]的方法進行，并略有改進。34對SSR引物序列均來自于http：//ukcrop.net（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系與循環(huán)參數(shù)參照陸光遠等[8]報道的方法進行，擴增產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察、拍照。

表1 16份供試油菜材料的名稱及來源

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 根據(jù)SSR電泳圖譜顯示的結果，按照各引物在相同電泳遷移率位置上PCR擴增產(chǎn)物帶的有無進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,其中有帶記為1，無帶記為0，組成1和0的原始矩陣。采用生物學軟件NTSYS-pc2.10e進行數(shù)據(jù)分析，先利用SimQual程序計算材料間的遺傳相似系數(shù)（Genetic Similarity,GS），獲得相似系數(shù)矩陣，再用SHAN程序中的UPHMA進行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類樹狀圖,并以簡單配對參數(shù)計算基因頻率。按照Nei提出的公式計算SSR位點的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content,PIC），PIC=1-∑fi2，其中 fi為 i位點的基因頻率[9]。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的多態(tài)性表現(xiàn)

34對SSR引物在16份供試油菜材料中共產(chǎn)生72條清晰的擴增條帶，平均每對引物產(chǎn)生2.12條。擴增條帶長度在100～650 bp之間，以150～350 bp的片段為主。圖1為引物CB10364和MR049對供試材料的SSR擴增結果，其他引物的擴增效果基本與該引物的擴增效果相當。在34對SSR引物中，28對引物的PCR擴增條帶在供試材料中表現(xiàn)出明顯多態(tài)性，多態(tài)性比例為82.4%。多態(tài)性位點的PIC值在0.12～0.73之間，平均為0.39，其中以引物CB10427的最高（0.73），引物BnGMS633、BnGMS687、Na12-A02、Na12-E09、Na10-D11、Na10-D08的最低，平均為0.12。由此可見，研究選用的SSR引物具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，也表明供試材料在這些位點存在較高的遺傳變異。

表2 SSR引物序列信息

圖1 引物CB10364和引物MR049對16份供試材料的SSR-PCR擴增

2.2 聚類分析

利用生物學軟件NTSYS-pc2.10e對16份供試油菜材料進行聚類分析，結果表明供試的16份材料可以被完全區(qū)分開，各材料間的遺傳相似系數(shù)在0.52～0.90之間，平均為0.63。其中，10個pol-CMS恢復系間的遺傳相似系數(shù)在0.52～0.90之間，平均為0.61；3個pol-CMS不育系間遺傳相似系數(shù)在0.71～0.86之間，平均為0.79；2個溫敏核不育系間的遺傳相似系數(shù)為0.90。如圖2所示，在遺傳相似系數(shù)為0.685時，供試材料可分為A、B、C 3個類群。A類群包含7份材料（5份pol-CMS恢復系、2份溫敏核不育系）；B類群包含8份材料（4個pol-CMS不育系、4個pol-CMS恢復系）；C類群僅包含1份pol-CMS恢復材料。研究結果表明，在16份供試材料中，pol-CMS恢復系材料間存在較好的遺傳多樣性，pol-CMS不育系材料間的遺傳多樣性相對較差，2份溫敏核不育系材料的遺傳背景非常相近。

3 討論

研究利用選取的34對SSR引物對16份供試油菜育種材料進行了遺傳分析，結果表明在供試材料中，pol-CMS恢復系材料間具有較好的遺傳多樣性，而pol-CMS不育系材料與溫敏核不育系材料的遺傳多樣性較狹窄。該結果可能與以上育種材料的選育方法密切相關，研究中pol-CMS恢復系大多通過同質恢復系進行選育，即通過已有雜交組合直接自交純合，或利用已有的pol-CMS恢復系材料直接回交轉育，其恢復系材料的遺傳基礎易于拓展，遺傳背景相對廣泛。而pol-CMS不育系的選育主要源于對已有不育系的回交改良，該類型不育系存在不同程度的低溫敏感現(xiàn)象，因此pol-CMS不育系的選育對核心親本的依賴性較強，往往幾個不育系均含一個核心不育系的血緣。另外，研究中溫敏核不育系材料由于受多對隱性基因控制，新型系轉育更為困難，研究供試的2個溫敏核不育系均來源于隱性核不育系86A后代分離群體，有著明顯的遺傳相似性。

對16份供試材料的聚類結果表明，來源于中國農(nóng)業(yè)科學院油料研究所中油雜系列的Z2R、Z8R優(yōu)先聚到一起，來源于隱性核不育系86A的91S、402S優(yōu)先聚到一起，含有SC4的血緣的169A與SC4優(yōu)先聚到一起，通過品質改良17A選育的不育系167A與17A也優(yōu)先聚到一起。這充分說明SSR揭示的遺傳多樣性與地理來源和系譜來源基本一致，可以充分反映材料間的遺傳差異。在該研究中恢復系95-5單獨聚為一類，與其他材料間具有明顯的遺傳特異性，而在表型上該恢復系確實具有土黃色花瓣、種皮自然開裂等非常特殊的農(nóng)藝性狀，需注意對該特異種質資源的保存和利用。由此可見，SSR聚類結果較好地反映了材料間的親緣關系，可為育種資源的有效利用提供參考。

[1]梅德圣，李云昌，胡 瓊，等.甘藍型油菜中油雜8號種子純度的 SSR 鑒定[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（5）：49-52.

[2]吳朝暉.SSR標記及其在水稻遺傳育種中的研究進展 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2007，（3）：36-39.

[3]趙衛(wèi)國，王 灝，李殿榮，等.甘藍型特高含油量油菜種質及其主栽品種的指紋圖譜構建 [J].植物遺傳資源學報，2011，12（6）：904-909.

[4]胡景濤，黃文章，嚴明建，等.重慶市雜交水稻主要親本的SSR遺傳多態(tài)性分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2011，（4）：1-6.

[5]許 鯤，張冬曉，伍曉明，等.國家冬油菜區(qū)試新品種SSR指紋圖譜構建與遺傳關系分析 [J].中國油料作物學報，2008，30（1）：29-34.

[6]朱 英，陶 剛，祝云芳，等.利用SSR標記分析12份優(yōu)良玉米自交系的遺傳多樣性[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2011,39(8)：18-20.

[7]Murry H G,Thomspon W F.Rapid isolation of weight DNA[J].Nucleic Acides Res,1980,8：4321-4325.

[8]陸光遠，楊光圣，傅廷棟.一個簡便的適合于分析油菜中SSR位點的檢測體系[J].中國油料作物學報，2003，25（3）：79-81.

[9]Nei M.Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proc.Natl.Acad.Sci.,1973,70：3321-3323.