王 立，徐亞男，馬 放，張淑娟，張 雪，李 哲

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)是自然界中普遍存在的叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)和植物形成的互惠互利共生體，世界上90%以上的植物種類都能形成AM［1］.絕大多數(shù)維管植物理論上都可以用作AMF菌劑生產(chǎn)的宿主植物，如高粱、洋蔥、大麥、玉米、苜蓿、三葉草、花生、棉花、蘆筍、百喜草、蘇丹草等［2］，AMF能促進(jìn)宿主對(duì)土壤中礦質(zhì)元素磷、氮、鉀、銅、鋅等的吸收，提高宿主根系對(duì)根部病菌的抵抗力，增強(qiáng)植物對(duì)干旱、高溫、重金屬的抗性，促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)［3］，廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧、園藝［4］、林木［5-6］、藥材［7－8］、土壤修復(fù)［9-11］等方面，依托AMF的優(yōu)良特性，作為草坪草養(yǎng)護(hù)管理的微生物菌劑，具有廣闊的應(yīng)用前景.

白三葉草的葉色、花色美觀，綠色期極長(zhǎng)，可連續(xù)利用6～7年甚至10年，是優(yōu)良的綠化觀賞草坪種.其根系具有很強(qiáng)的分蘗能力和再生能力，側(cè)根密集，蓄水保土作用明顯，適宜在坡地、堤壩湖岸種植，防止水土流失.但其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求較高，需在扶壯過程中追施氮、磷等化學(xué)肥料［12］，一方面增加養(yǎng)護(hù)難度和費(fèi)用，另一方面極易造成面源污染，影響生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，成為白三葉草坪應(yīng)用推廣的限制因素.針對(duì)這一問題，選用摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)兩種性能優(yōu)越的土著廣適菌種，分別探討單獨(dú)施加和混合施加與白三葉草的共生關(guān)系，以及AMF菌劑對(duì)白三葉草的生長(zhǎng)效應(yīng)與營(yíng)養(yǎng)吸收的促進(jìn)作用，得到有效促進(jìn)白三葉草坪生長(zhǎng)的最佳AMF菌劑，為以后菌劑在白三葉草坪養(yǎng)護(hù)、管理中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 試驗(yàn)

1.1 材料

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)田.位于黑龍江省雙城市前進(jìn)鄉(xiāng)的大田試驗(yàn)基地(E:125°41'－126°42'，N:45°08'－45°43');土壤中水解性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為108.22mg/kg，有效磷424.77mg/kg;試驗(yàn)所用AMF菌劑為摩西球囊霉(Glomus mosseae，GM)、根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices，GI)和兩種菌劑的混合菌(GM+GI);受試草坪草宿主為白三葉草(Trifolium repens).

1.2 試驗(yàn)田設(shè)計(jì)

小區(qū)均為邊長(zhǎng)8m的正方形，面積為64m2，于小區(qū)中間6×6=36m2內(nèi)的正方形中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)置，最外圍2m為保護(hù)區(qū)及保護(hù)行，每塊試驗(yàn)田均為邊長(zhǎng)6m、深度20cm的立方體，實(shí)驗(yàn)前于底部鋪設(shè)1cm厚細(xì)沙，覆安全網(wǎng)(既可以滲水又可用于阻斷試驗(yàn)土壤與自然土壤的接觸，且方便滅菌)，覆土.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大田滅菌

每平方米土壤施用150mL福爾馬林(每塊試驗(yàn)區(qū)施加150×6×6=5400mL)，拌勻，蓋膜，連續(xù)每天采集土樣，采用平板計(jì)數(shù)法，分別使用孟加拉紅培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌和細(xì)菌，直至真菌基本不長(zhǎng)、細(xì)菌少量存活時(shí)揭膜，7d后待福爾馬林揮發(fā)盡后播種.

1.3.2 AMF接種方法

采用條播的方法于土壤中接種AMF菌劑(每垅30g)及白三葉草種子，每個(gè)小區(qū)20垅，播種間距1cm，實(shí)驗(yàn)田的設(shè)置分別為:不接菌，接種GM、GI，兩種菌的混合菌(GM+GI)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).

1.3.3 菌根依賴性計(jì)算

接種70 d后，從每塊試驗(yàn)田隨機(jī)抽取20株，于每株苗上隨機(jī)剪取5條營(yíng)養(yǎng)根，并剪為2 cm長(zhǎng)的根段，混勻，從中揀取 60段，應(yīng)用酸性品紅染色法進(jìn)行染色，在高倍光學(xué)顯微鏡下檢驗(yàn)菌根侵染情況，得到侵染率.AMF侵染率=(侵染根段數(shù)/觀察根段數(shù))×100%.

植物的地上菌根依賴指數(shù)IMPD(Mycorthizal Plant Dependence)、地下菌根依賴指數(shù)IMFD(Mycorthizal Foot Dependence)及植物菌根依賴指數(shù)IMD(Mycorthizal Dependence)計(jì)算如下:

IMD=(施加菌劑后的植株總生物量/不施加菌劑時(shí)植株總生物量)×100%;

IMPD=(施加菌劑后的植株地上生物量/不施加菌劑時(shí)植株地上生物量)×100%;

IMFD=(施加菌劑后的植株地下生物量/不施加菌劑時(shí)植株地下生物量)×100%.

根據(jù)Nemec［13］的分類方法，將植物對(duì)菌根的依賴度分為3級(jí)，菌根依賴指數(shù)IMD=300%時(shí)為高強(qiáng)度依賴性，IMD=200%時(shí)為中等強(qiáng)度依賴性，IMD=100%時(shí)為弱依賴性或無(wú)依賴性.

1.3.4 AMF對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

分別測(cè)量不同接菌處理時(shí)白三葉草的株高、地上及地下生物量，并與空白試驗(yàn)作對(duì)比，闡述AMF對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，計(jì)算植物菌根依賴指數(shù).

1.3.5 AMF對(duì)根際土壤營(yíng)養(yǎng)元素的影響

采用堿解－擴(kuò)散和碳酸氫鈉法分別對(duì)根際土壤中的水解性氮、有效磷進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算利用率，以空白對(duì)照(CK)的利用率為100%.

菌劑處理后植物對(duì)根際土壤中水解性氮的利用率=［(不施加菌劑時(shí)根際水解性氮含量－施加菌劑后根際水解性氮含量)/不施加菌劑時(shí)根際水解性氮含量×100%］+100;

菌劑處理后植物對(duì)根際土壤中有效磷的利用率=［(不施加菌劑時(shí)根際有效磷含量－施加菌劑后根際有效磷含量)/不施加菌劑時(shí)根際有效磷含量×100%］+100.

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Spss17.0進(jìn)行單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根依賴性研究

植物菌根依賴性是判斷植物對(duì)AMF的依賴程度及AMF對(duì)植物促進(jìn)效果的重要指標(biāo).實(shí)驗(yàn)表明，選用的兩種AMF均能有效侵染白三葉草，形成菌根共生體，但不同菌劑對(duì)白三葉草的侵染率不同(圖1).

圖1 AMF對(duì)白三葉草的侵染效果

自然條件下，不施加菌劑的處理(CK)中，AMF的侵染率很低(2.09%).與CK相比，施加菌劑可顯著提高AMF對(duì)白三葉草的侵染作用(P＜0.05).其中，摩西球囊霉對(duì)白三葉草的侵染效果最優(yōu)，侵染率可達(dá)53.84%，顯著高于根內(nèi)球囊霉的侵染率(22.37%)(P＜0.05).兩種菌劑混合施加的侵染效果居中(侵染率28.78%)，顯著低于摩西球囊霉的侵染率，高于根內(nèi)球囊霉，但與其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果表明，摩西球囊霉對(duì)白三葉草的侵染效果最佳，單菌(GM)的侵染效果優(yōu)于混菌.

AMF對(duì)植物的侵染作用可有效改善白三葉的生長(zhǎng)狀況，其表現(xiàn)為白三葉草不同營(yíng)養(yǎng)器官(地上、地下)對(duì)AMF的菌根依賴性(圖2).

將不施加菌劑的對(duì)照處理(CK)植物的菌根依賴指數(shù)設(shè)為100%(IMD=100%)，與CK相比，施加不同菌劑可顯著提高植物的菌根依賴性(P＜0.05).其中，施加單菌時(shí)，摩西球囊霉(IMD=144%)、根內(nèi)球囊霉(IMD=162%)二者的效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.而施加兩種菌的混合菌時(shí)明顯優(yōu)于單菌，且效果顯著(P＜0.05)(IMD=249%)，說(shuō)明植物對(duì)混菌的菌根依賴性強(qiáng)于單菌(圖2(a)).

與對(duì)照相比，施加菌劑可顯著提高植物地上、地下部分的菌根依賴性(P＜0.05)(圖2(b)).其中，白三葉草地上部分對(duì)混菌的依賴性(IMD=308%)顯著高于對(duì)單菌的依賴性 (IMD=180%)，為高強(qiáng)度依賴.白三葉草地下部分對(duì)AMF菌劑的依賴性，混菌與單菌效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.白三葉草地上部分對(duì)菌劑的依賴性最強(qiáng)，且明顯高于地下部分.

圖2 白三葉草的菌根及其地上、地下部分的菌根依賴性

2.2 AMF對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

植物株高、生物量是反應(yīng)植物生長(zhǎng)情況的有效指標(biāo)，施加AMF可明顯促進(jìn)白三葉草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其株高及生物量(地上、地下)均有顯著提高，不同菌劑處理對(duì)植物生長(zhǎng)具有不同的促進(jìn)效果(圖3、4).

圖3 AMF對(duì)白三葉草株高的影響

圖4 AMF對(duì)白三葉草地上、地下生物量的影響

株高是草坪建植質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，能夠反映草坪草的生長(zhǎng)狀態(tài)和整齊性.白三葉草坪建植的經(jīng)驗(yàn)管理高度為20 cm，超過這一高度則需要進(jìn)行刈割，以避免出現(xiàn)倒伏和不整齊現(xiàn)象.在不施加菌劑(CK)時(shí)，白三葉草平均株高為(19±0.7)cm，低于刈割高度，表明無(wú)施肥管理不能滿足草坪建植要求.施加菌劑可顯著促進(jìn)白三葉草的生長(zhǎng)(P＜0.05)，且均能滿足刈割高度.其中，單獨(dú)施加摩西球囊霉(株高27±1.5 cm)和混合施加(株高27±1.0 cm)時(shí)植物的長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.兩種菌劑的混合施加對(duì)白三葉草的促進(jìn)效果顯著高于根內(nèi)球囊霉(P＜0.05).

與不施加菌劑(CK)相比，施加菌劑后可顯著提高白三葉草地上、地下生物量(P＜0.05)，尤其是對(duì)白三葉草地上生物量的促進(jìn)作用更為明顯.其中施加單菌時(shí)，摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉對(duì)植物地上及地下部分生物量的促進(jìn)作用相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.施加兩種菌的混合菌時(shí)，對(duì)白三葉草地上、地下生物量促進(jìn)作用最強(qiáng)，顯著高于任何一種單菌(P＜0.05)，植物地上、地下生物量分別提高76.6%、35.7%.說(shuō)明混菌更有效地促進(jìn)白三葉草同化物質(zhì)的積累，對(duì)植物的生長(zhǎng)更有益.

2.3 AMF對(duì)植物根際土壤氮、磷的影響

菌劑對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是通過對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收利用的改善來(lái)實(shí)現(xiàn)的，施加AMF可有效增強(qiáng)植物對(duì)土壤中水解性氮及有效磷的吸收能力(圖5).

在不施加菌劑(CK)時(shí)，植物對(duì)根際土壤中水解性氮、有效磷的吸收率很低，植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、利用效果差.施加菌劑可明顯提高白三葉草對(duì)水解性氮、有效磷的吸收能力，且效果顯著(P ＜0.05).

在促進(jìn)水解性氮吸收上，單獨(dú)施加摩西球囊霉的效果(與CK相比，可提高46.47%)顯著好于根內(nèi)球囊霉(與 CK相比，可提高33.23%)(P＜0.05).而施加兩種菌的混合菌時(shí)，其效果顯著高于單菌(與 CK相比，可提高50.33%)(P＜0.05)，說(shuō)明在促進(jìn)白三葉草對(duì)根際土壤水解性氮吸收方面，混菌優(yōu)于單菌.

在促進(jìn)有效磷吸收上，單獨(dú)施加摩西球囊霉與根內(nèi)球囊霉時(shí)的效果最好，二者效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，植物根際土壤中的有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，可由424.77 mg/kg降至142.17 mg/kg，對(duì)有效磷的利用率提高48%，且單菌促進(jìn)效果好于混菌，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明在促進(jìn)白三葉草對(duì)根際土壤中有效磷的吸收方面，單菌優(yōu)于混菌.

圖5 AMF對(duì)根際土壤中水解性氮、有效磷吸收率的促進(jìn)效果

2.4 植物生長(zhǎng)與根際土壤氮、磷的關(guān)系

為確定在施加AMF菌劑條件下，宿主植物生長(zhǎng)與土壤養(yǎng)分的關(guān)系，對(duì)土壤中能夠被植物直接利用的主要營(yíng)養(yǎng)元素(水解性氮和有效磷)的豐缺度進(jìn)行了分析［14］，并對(duì)其與植物生長(zhǎng)指標(biāo)(株高)之間的關(guān)系進(jìn)行了定量分析，其結(jié)果如圖6所示.

根據(jù)第二次全國(guó)土壤普查中水解性氮與有效磷含量的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可知［15-19］，黑龍江土壤屬于氮缺乏、磷盈余的土壤類型.隨著受試植物的生長(zhǎng)，土壤中可被植物利用的活性氮水平與植物的株高有顯著的線性負(fù)相關(guān)關(guān)系.隨著植物株高的增加，植物根際土壤中殘留的水解性氮含量急劇減少，在有菌劑存在的條件下，氮元素的供給仍不能夠達(dá)到作物生長(zhǎng)的飽和需求，成為植物生長(zhǎng)的限制因子.

圖6 根際土壤中水解性氮、有效磷與株高的關(guān)系

氮是植物生長(zhǎng)需要的大量元素，而我省土壤水解性氮含量本底值低、耗竭嚴(yán)重，在植物培養(yǎng)過程中需要底肥來(lái)培肥土壤，施加菌肥對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，雖能達(dá)到白三葉草坪建植的生長(zhǎng)需要，但是在白三葉草的生長(zhǎng)與水解性氮利用關(guān)系曲線中可以得出，植物生長(zhǎng)元素利用尚未達(dá)到飽和臨界點(diǎn)，適量補(bǔ)充氮肥條件下，白三葉的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)尚有提高空間.

受試土壤中，速效磷水平較高，屬于磷盈余狀態(tài).植物生長(zhǎng)株高與磷之間呈現(xiàn)飽和曲線規(guī)律，在無(wú)菌劑施加條件下，植物土壤中殘余的磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)420 mg/kg，菌劑施加對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)提高了植物對(duì)土壤中磷元素的利用效率.在土壤殘留150 mg/kg的磷營(yíng)養(yǎng)水平時(shí)，即使植物進(jìn)一步生長(zhǎng)，對(duì)磷的需求也不會(huì)有太大的波動(dòng)，達(dá)到飽和狀態(tài).實(shí)際生產(chǎn)過程中，施加菌劑時(shí)可滿足植物對(duì)磷的吸收利用，白三葉草坪扶壯過程中無(wú)需追施磷肥.

3 結(jié)論

1)白三葉草能與AMF形成菌根共生體.摩西球囊霉對(duì)白三葉草的侵染效果最佳，侵染率可達(dá)53.84%，優(yōu)于混菌，但是白三葉草對(duì)混菌的菌根依賴性最強(qiáng)，且在植物的營(yíng)養(yǎng)器官中，其地上部分較地下部分對(duì)菌劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的菌根依賴性.

2)施加AMF后，可明顯促進(jìn)白三葉草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其株高及生物量(地上、地下)均有顯著提高，混菌為最佳菌劑，株高、地上及地下生物量的扶壯率可分別增加40.7%、76.6%、35.7%.

3)施加AMF菌劑后，可明顯改善白三葉草對(duì)根際土壤中水解性氮、有效磷的利用效果.在實(shí)際生產(chǎn)過程中，可適量配施少量氮肥進(jìn)行草坪扶壯管理.

［1］易時(shí)來(lái)，溫明霞.VA菌根改善植物磷素營(yíng)養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004(5):164-166.

［2］MENGE J A.Inoculum production［C］//VA Mycorrhiza.USA:CRC Press，Raton Florida USA，1984:187－204.

［3］SNDERS F E，TINKER P B.Phosrhato flow into mycorrhizal root［J］.Pestic Sci，1973(4):385 － 395.

［4］李瑞卿，劉潤(rùn)進(jìn)，李敏.園藝作物菌根及其在生態(tài)農(nóng)業(yè)的應(yīng)用［J］.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，10(1):24－26.

［5］陳羽，弓明欽，仲崇祿.菌根菌劑在華南地區(qū)林業(yè)及農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用［J］.廣東林業(yè)科技，2004，20(1):50－53.

［6］ HELGASON T，MERRYWEATHERJ W，DENISON J，et al.Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of cooccurring fungi and plants from a temperate deciduous wood land［J］.J Ecol，2002，90:371 －384.

［7］任嘉紅，劉瑞祥，李云玲.三七叢枝菌根(AM)的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(2):224 －227.

［8］楊光，郭蘭萍，黃璐琦，等.藥用植物的叢枝菌根接種方法研究［J］.資源科學(xué)，2008，30(5):778－785.

［9］BEATH J M.Consider phytoremediation for waste site cleanup［J］.Chem Eng Prog，2000，96(7):61 －69.

［10］BULLARD R D.Dumping in Dixie:race，class，and environmental quality［M］.New York:Westview Press，2000:201.

［11］RISER R E.Remediation of pet folium contaminated soils:biological，physical and chemical processes［M］.Boca Raton:Lewis Publishers Inc，1998.

［12］吳建峰，林先貴.我國(guó)微生物肥料研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.土壤，2002，34(2):68－72.

［13］NEMEC S.Response of Citrus rootstoks to 3 species of Glomus［C］//Proc Fla State Hortic Soc.［S.l.］:［s.n.］，1978:10－91.

［14］中國(guó)土壤學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)化學(xué)專業(yè)委員會(huì).土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)常規(guī)分析方法［M］.北京:科學(xué)出版社，1983.

［15］全國(guó)土壤普查辦公室.中國(guó)土種志(第一卷)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1993:924.

［16］全國(guó)土壤普查辦公室.中國(guó)土種志(第二卷)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1994:730.

［17］全國(guó)土壤普查辦公室.中國(guó)土種志(第三卷)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1994:744.

［18］全國(guó)土壤普查辦公室.中國(guó)土種志(第四卷)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1995:806.

［19］全國(guó)土壤普查辦公室.中國(guó)土種志(第五卷)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1996:880.