韓國全 余 冰，2 陳代文，2* 相振田 陳渝 陳洪 毛倩

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

蘇氨酸(threonine，Thr)由學(xué)者 Rose 等［1－3］在20世紀(jì)30年代年通過關(guān)于氨基酸組成的動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)中預(yù)測(cè)并證實(shí)的，而且從纖維蛋白質(zhì)水解混合物中首次獲得純分離物，因其空間結(jié)構(gòu)與蘇糖相似而命名。蘇氨酸是動(dòng)物飼糧中的第二或第三限制性氨基酸，具有突出的生理功效，對(duì)其研究一直是動(dòng)物營養(yǎng)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。良好的免疫功能是動(dòng)物獲得最佳生產(chǎn)性能的基礎(chǔ)，而良好的營養(yǎng)水平亦是動(dòng)物獲得最佳免疫水平的基礎(chǔ)。蘇氨酸在氨基酸營養(yǎng)中具有關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)免疫的影響也較大，近年來其在分子營養(yǎng)與免疫領(lǐng)域引起了相關(guān)學(xué)者的極大關(guān)注。Fuller等［4］與Stoll等［5］報(bào)道健康的腸道可吸收截留來自飼糧中60% ～80%蘇氨酸，與其他腸道蛋白質(zhì)相比，腸道黏膜蛋白中尤其富含蘇氨酸(占其氨基酸組成的30%)。Wang等［6］在研究人工感染大腸桿菌的斷奶仔豬時(shí)觀察到，增加飼糧中的蘇氨酸含量，抗體產(chǎn)量增加，血清中免疫球蛋白G(IgG)濃度以及回腸黏膜中IgG和免疫球蛋白(IgA)的濃度均有所提高，同時(shí)降低了回腸黏膜中白介素6(IL－6)的含量。Faure等［7］通過研究氨基酸合成代謝反應(yīng)對(duì)蘇氨酸的利用率發(fā)現(xiàn)，小鼠感染敗血癥時(shí)對(duì)蘇氨酸需要的增幅高于其他必需氨基酸。Remond等［8］利用迷你豬動(dòng)物模型，考察急性回腸炎應(yīng)激下胃腸道蘇氨酸攝入與黏液素的合成特點(diǎn)，結(jié)果顯示小腸蘇氨酸水平對(duì)黏膜蛋白和黏液素合成影響較大，腸內(nèi)補(bǔ)充蘇氨酸顯著減輕臨床腸道炎癥。疫病應(yīng)激下機(jī)體快速合成大量的急性期蛋白和免疫球蛋白，這些蛋白的氨基酸組成不同于機(jī)體組織，蘇氨酸的比例要高于機(jī)體組織，因此，它的需要量大幅增加。

IPEC－J2細(xì)胞是分離自未吮乳的新生仔豬空腸上皮細(xì)胞，屬于非轉(zhuǎn)化性最初的連續(xù)培養(yǎng)小腸細(xì)胞系，具有典型的豬小腸上皮細(xì)胞特性［9］，因此，IPEC－J2細(xì)胞可以作為極好的小腸體外模型用以研究營養(yǎng)物質(zhì)與小腸上皮細(xì)胞的作用機(jī)制。豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科甲皰疹病毒亞科，主要特征是宿主范圍廣，有高度的細(xì)胞致病性且復(fù)制周期短。研究證實(shí)多數(shù)雜交瘤細(xì)胞系和原代細(xì)胞都適合PRV的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室多用PK－15或SK－6細(xì)胞，PRV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變(CPE)一般出現(xiàn)在攻毒后的24～72 h。PRV感染致病時(shí)，所有被波及的組織均呈灶性壞死。Narita等［10］研究發(fā)現(xiàn)PRV感染在小腸發(fā)生黏膜上皮灶性壞死病變時(shí)，可能波及至黏膜肌層和外膜，核內(nèi)包涵體見于受損的腸上皮細(xì)胞，胞核發(fā)生明顯的固縮和核碎裂。作者將PRV接種IPECJ2細(xì)胞，72 h觀察到細(xì)胞呈典型“拉網(wǎng)狀”和細(xì)胞脫落的CPE，病毒檢測(cè)陽性，證實(shí)PRV能夠成功感染IPEC－J2細(xì)胞。本研究以 IPEC－J2細(xì)胞為小腸細(xì)胞體外模型，考察補(bǔ)充不同水平蘇氨酸對(duì)感染PRV的細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在從分子水平深入理解蘇氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)毒株與細(xì)胞株

PRV野毒株Fa株:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖凍存;IPEC－J2細(xì)胞:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所豬營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室繁殖凍存。

1.1.2 主要試劑

蘇氨酸以L－蘇氨酸形式添加，為美國Sigma公司產(chǎn)品;總RNA提取試劑(TRIzolReagent)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑(iScriptTMcDNA Synthesis Kits)、定量 PCR試劑(SoFastTMEvaGreenSupermix)均為美國 Bio－Rad公司產(chǎn)品;細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基［DMEM/F－12(1∶1)］干粉、胎牛血清(FCS)、細(xì)胞消化液(0.25%trypsin－EDTA)均為美國HyClone公司產(chǎn)品;相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000為大連寶生物公司產(chǎn)品;核酸染料(GoldViewTM)為北京賽百勝基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

電熱水浴二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Revco UltimaⅡ)為美國Thermo公司產(chǎn)品;超純水儀(Milli－Q)為美國Millipore公司產(chǎn)品;倒置生物顯微鏡(TS100－F)為日本Nikon公司產(chǎn)品;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX096)、梯度PCR儀(MyCycler Thermal Cycler)、凝膠成像系統(tǒng)(GEL DOC2000)、穩(wěn)壓電泳儀(PowerPac Universal)均為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)(Allegra 64R)為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選用IPEC－J2細(xì)胞模型，分為4組，對(duì)照組未經(jīng)偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV感染、蘇氨酸濃度為53.45 mg/L，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為試驗(yàn)組，經(jīng)PRV感染，蘇氨酸濃度分別為53.45、106.90、160.35 mg/L。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4孔。

1.2.2 試劑配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:取12.1 g(1袋)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉溶于950 mL超純水中，超純水沖洗包裝袋3～5次，磁力攪拌溶解，加入1.2 g碳酸氫鈉和適量4－羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液調(diào)整pH至7.0左右，定容至1 000 mL，不銹鋼濾器(孔徑0.22 μm)過濾除菌，分裝并抽樣無菌檢驗(yàn)，置于4℃避光保存。

完全培養(yǎng)基:無菌操作將胎牛血清按照10%(體積比)加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于4℃避光保存。

蘇氨酸儲(chǔ)備液(53.45 g/L):稱取1.069 0 g L－蘇氨酸，室溫(20℃)下溶于20 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，0.22 μm 過濾除菌，以 1.5 mL/管分裝于2.0 mL無菌離心管，－20℃避光保存。

補(bǔ)充蘇氨酸的培養(yǎng)基:將蘇氨酸儲(chǔ)存液恢復(fù)至室溫，混勻，按合適比例加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別配制蘇氨酸濃度為 53.45、106.90、160.35 mg/L的培養(yǎng)基，置于4℃避光保存。

1.2.3 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)

IPEC－J2細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)基，待80%～100%融合時(shí)用細(xì)胞消化液消化傳代，培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2電熱水浴二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.4 病毒增殖與滴度測(cè)定

采用IPEC－J2細(xì)胞增殖PRV，離心過濾收集病毒液。同時(shí)使用IPEC－J2細(xì)胞測(cè)定PRV的病毒滴度，采用 Reed－Muench兩氏法［12］計(jì)算病毒組織半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.5 PRV感染與蘇氨酸處理

將消化后的IPEC－J2細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基稀釋懸液至 5.0×105個(gè)/mL，以 200 μL/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)盤，共接種4盤。置于37℃、5%CO2電熱水浴二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察細(xì)胞，24 h更換1次培養(yǎng)基。待75% ～85%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)基，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌2～3次后，對(duì)照組每孔分別加入200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)組則每孔分別加入200 μL PRV病毒稀釋液(1 TCID50/μL)，平均到4個(gè)盤上;置于 37℃、5%CO2中吸附1 h，每15 min勻速搖振細(xì)胞培養(yǎng)盤以確保充分吸附病毒;完全吸除各孔中液體，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌2次，每孔分別加入相應(yīng)補(bǔ)充L－蘇氨酸的培養(yǎng)基800 μL，置于37℃、5%CO2孵育。IPEC－J2細(xì)胞的PRV感染、蘇氨酸補(bǔ)充見表1。

分別于加入處理培養(yǎng)基后1、6、12、24 h取相應(yīng)培養(yǎng)盤細(xì)胞，吸除上清，每孔加入0.5 mL總RNA提取試劑，室溫裂解細(xì)胞5～10 min后轉(zhuǎn)移至無菌1.5 mL離心管中，置于－75℃凍存?zhèn)溆谩?.2.6 細(xì)胞總RNA的制備和反轉(zhuǎn)錄

參照總RNA提取試劑說明書，提取細(xì)胞總RNA，并用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)處理制備的細(xì)胞總RNA樣品，置于－75℃凍存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄參照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行，cDNA產(chǎn)物置于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR

采用豬持家基因(housekeeping gene)β－肌動(dòng)蛋白(β－actin)作為內(nèi)參基因。登錄美國NCBI網(wǎng)站，從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索并下載保存豬的白介素 1β(IL－1β)、IL－6、白介素 15(IL－15)、腫瘤壞死因子 α(TNF－α)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF－β1)及 βactin的基因序列。綜合應(yīng)用軟件Oligo 7.0與Primier 5.0自行設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，引物序列及參數(shù)見表2。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR、產(chǎn)物回收及TA克隆均參照文獻(xiàn)［11］相關(guān)方法操作，TA克隆質(zhì)粒交由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 IPEC－J2細(xì)胞的偽狂犬病病毒感染、蘇氨酸補(bǔ)充Table 1 PRV infection and Thrsupplementation of IPEC－J2 cell

采用10倍倍比稀釋的方法將PCR產(chǎn)物的重組質(zhì)粒稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)品，以此標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，每個(gè)稀釋度樣品做2個(gè)技術(shù)性重復(fù)，根據(jù)閾值循環(huán)(Ct)以及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下:SoFastTMEvaGreenSupermix 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物 1.0 μL，RNase/DNase－free water 7.0 μL，cDNA 1.0 μL，總體積 20.0 μL;擴(kuò)增參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性30 s，95℃ 3 s，60～65℃(具體參考每個(gè)基因的退火溫度)3 s，40個(gè)循環(huán);溶解曲線參數(shù)為:65～95℃，每5 s上升0.5℃。所有基因表達(dá)量均以β－肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，以相對(duì)表達(dá)量來表示，相對(duì)定量數(shù)據(jù)的計(jì)算采用Pfaffl［13］建立的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用GLM下Univariate程序進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié)果

蘇氨酸對(duì)體外培養(yǎng)感染PRV的IPEC－J2細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響見表3。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers for the real－time PCR

IL－1β mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，PRV感染顯著降低了Ⅰ組 IL－1β mRNA表達(dá)量(P=0.040)，時(shí)間(P=0.127)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.333)的影響均不顯著;PRV感染極顯著降低了Ⅱ組 IL－1β mRNA表達(dá)量(P=0.001)，時(shí)間(P=0.051)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.165)的影響均不顯著;隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅲ組IL－1β mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染極顯著降低了IL－1β mRNA表達(dá)量(P=0.002)，時(shí)間與PRV感染交互作用的影響極顯著(P=0.005)。PRV感染的3組相比，隨時(shí)間增加，IL－1β mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.000);蘇氨酸水平(P=0.830)、時(shí)間與蘇氨酸水平交互作用(P=0.249)的影響均不顯著。

IL－6 mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，時(shí)間(P=0.090)、PRV 感染(P=0.162)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.075)對(duì)Ⅰ組 IL－6 mRNA表達(dá)量的影響均不顯著;隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅱ組IL－6 mRNA表達(dá)量極顯著地先升高后降低(P=0.014)，PRV感染(P=0.619)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.812)的影響均不顯著;隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅲ組IL－6 mRNA表達(dá)量極顯著地先升高后降低(P=0.000)，PRV感染(P=0.346)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.142)的影響均不顯著。PRV感染的3組相比，時(shí)間的影響不顯著(P=0.587);隨蘇氨酸水平增加，IL－6 mRNA表達(dá)量極顯著地先升高后降低(P=0.002);時(shí)間與蘇氨酸水平交互作用的影響顯著(P=0.012)。

IL－15 mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，時(shí)間均極顯著先升高后降低3個(gè)試驗(yàn)組的IL－15 mRNA表達(dá)量(P=0.000)，PRV感染均極顯著提高了 IL－15 mRNA 表達(dá)量(P=0.000)，時(shí)間與PRV感染交互作用亦均極顯著(P=0.000)。PRV感染的3組相比，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，IL－15 mRNA表達(dá)量極顯著地先升高后降低(P=0.000);隨蘇氨酸水平升高，IL－15 mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.000);時(shí)間與蘇氨酸水平交互作用的影響亦極顯著(P=0.000)。

TNF－α mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，PRV感染極顯著提高了Ⅰ組TNF－α mRNA表達(dá)量(P=0.000)，時(shí)間(P=0.451)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.072)的影響均不顯著;時(shí)間(P=0.002)的增加、PRV感染(P=0.000)均極顯著提高了Ⅱ組TNF－α mRNA表達(dá)量，時(shí)間與PRV感染交互作用的影響顯著(P=0.043);時(shí)間(P=0.034)的增加、PRV感染(P=0.000)分別顯著、極顯著提高了Ⅲ組TNF－α mRNA表達(dá)量，時(shí)間與PRV感染交互作用的影響不顯著(P=0.106)。PRV感染的3組相比，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，TNF－α mRNA表達(dá)量極顯著地先提高后降低(P=0.001);蘇氨酸水平(P=0.113)、時(shí)間與蘇氨酸水平交互作用(P=0.195)的影響均不顯著。

TGF－β1 mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅰ組TGF－β1 mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染極顯著提高了 TGF－β1 mRNA 表達(dá)量(P=0.006)，時(shí)間與PRV感染交互作用顯著(P=0.042);隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅱ組TGF－β1 mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.001)，PRV感染(P=0.804)、時(shí)間與PRV感染交互作用(P=0.201)的影響均不顯著;隨培養(yǎng)時(shí)間增加，Ⅲ組TGF－β1 mRNA表達(dá)量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染影響不顯著(P=0.197)，時(shí)間與PRV感染交互作用的影響極顯著(P=0.001)。PRV感染的3組相比，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，TGF－β1 mRNA表達(dá)量極顯著地先升高后降低(P=0.000);蘇氨酸水平的影響不顯著(P=0.055)，時(shí)間與蘇氨酸水平交互作用的影響顯著(P=0.015)。

表3 蘇氨酸對(duì)體外培養(yǎng)感染偽狂犬病毒的IPEC－J2細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 2 Effects of Thr on immune－related gene expression of IPEC－J2 cell infected with pseudorabies virus in vitro

3 討論

3.1 關(guān)于細(xì)胞模型的選擇

機(jī)體胃腸道系統(tǒng)的單層上皮細(xì)胞起到重要的物理屏障作用，限制胃腸道中潛在有害微生物與腸道黏膜層外部分的接觸。黏膜蛋白是機(jī)體先天免疫反應(yīng)的重要物質(zhì)，黏膜防御的初級(jí)防線，而胃腸道上皮細(xì)胞就覆蓋1層豐富的黏膜蛋白，因此研究人員認(rèn)為上皮細(xì)胞介導(dǎo)了先天免疫的早期反應(yīng)［14］。因此，推測(cè)上皮細(xì)胞是目前研究營養(yǎng)物質(zhì)與先天免疫關(guān)系可行性較高的細(xì)胞模型。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，目前僅有3種永恒傳代的豬腸道細(xì)胞株:IPEC－1、IPEC－J2［15］和 轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞 系 IPI－2I［16］。IPEC－J2是非轉(zhuǎn)化、非致瘤腸上皮細(xì)胞株，保持了天然分化特性并呈現(xiàn)與原始腸上皮細(xì)胞高度相似性［9］，因此作者認(rèn)為IPEC－J2是研究營養(yǎng)物質(zhì)與腸道細(xì)胞免疫關(guān)系優(yōu)秀的細(xì)胞株。

3.2 補(bǔ)充蘇氨酸對(duì)感染PRV的IPEC－J2細(xì)胞基因表達(dá)的影響

豬群偽狂犬病、豬瘟等烈性疫病對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬造成重大經(jīng)濟(jì)損失，改善飼喂模式、增強(qiáng)遺傳抗病力、提高抵抗力和病原感染抵御能力是保障生產(chǎn)的關(guān)鍵。從營養(yǎng)的角度來看，飼料組成(氨基酸、能量和酶類)應(yīng)能夠提供激活相應(yīng)反應(yīng)的必需成分。蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸是豬非必需限制性氨基酸，豬群只能通過飼料來源獲得這些氨基酸。蘇氨酸對(duì)豬消化、免疫以及生殖系統(tǒng)生理功能均有重要作用［17］，因此研究特殊的生理狀態(tài)——病原微生物攻擊下，蘇氨酸水平與免疫的關(guān)系具有重要意義。Wang等［18］研究顯示，無論是飼糧蘇氨酸過高還是不足，均減少了育肥豬機(jī)體生長組織蛋白質(zhì)的合成，不利于機(jī)體健康。本研究選擇IPEC－J2細(xì)胞模型，考察補(bǔ)充添加不同水平的蘇氨酸對(duì)先天免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，從分子水平深入理解蘇氨酸對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞免疫功能的影響。

白介素1(IL－1)是一種炎癥和免疫源性細(xì)胞因子，既能協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞與T細(xì)胞的活化還能誘導(dǎo)其他炎性因子的產(chǎn)生、黏附分子的表達(dá)、白細(xì)胞浸潤的增加、誘導(dǎo)興奮性氨基酸和自由基的產(chǎn)生，啟動(dòng)多種細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)等［19］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組與對(duì)照組相比，PRV感染下調(diào)IL－1β mRNA表達(dá)，隨時(shí)間推移下調(diào)強(qiáng)度減弱;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸加強(qiáng)PRV感染下調(diào)IL－1β mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，且高水平(160.35 mg/L)蘇氨酸在1、6 h加強(qiáng)強(qiáng)度大于低(53.45 mg/L)、中水平(106.90 mg/L)，在12 h加強(qiáng)強(qiáng)度小于低、中水平，24 h則表現(xiàn)為略有上調(diào)趨勢(shì)。上述結(jié)果提示，補(bǔ)充高水平蘇氨酸在病毒感染早期抑制IL－1β mRNA的表達(dá)，隨后抑制減弱，甚或上調(diào)其表達(dá)。

IL－6主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，很少一部分由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等分泌［20］。IL－6具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用，可引起免疫炎癥反應(yīng)，是一種腸道炎性標(biāo)記物［21－22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組與對(duì)照組相比，PRV感染在1、6、12 h下調(diào)IL－6 mRNA表達(dá)，24 h則表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì);PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸緩解PRV感染下調(diào)趨勢(shì)，在1、6、12 h緩解PRV感染對(duì)其下調(diào)作用，高水平緩解作用較強(qiáng)，24 h則表現(xiàn)為Ⅰ組上調(diào)趨勢(shì)，Ⅲ組下調(diào)趨勢(shì)，Ⅱ組與對(duì)照組表達(dá)持平。上述結(jié)果提示，補(bǔ)充高水平蘇氨酸有利于減緩早期病毒感染腸道細(xì)胞致炎性，而后期表達(dá)水平的升高極可能源于病毒的過度增殖。

IL－15具有廣泛的生物學(xué)功能，被視作先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁因子之一［23－24］，在宿主抗病毒感染和惡性轉(zhuǎn)化的早期防御方面起重要作用［25］。IL－15在機(jī)體組織中分布極為廣泛，Grabstein等［26］采用Northern印跡法分析了各種組織和細(xì)胞中IL－15 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示其在人胎盤和骨骼肌中表達(dá)最豐富，在人心、肺、腎、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中也有不同程度的表達(dá)。Ashkar等［27－28］通過對(duì)小鼠的研究證實(shí)，IL－15 在機(jī)體先天性保護(hù)免受人Ⅱ型生殖器單純皰疹病毒感染中起關(guān)鍵性作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組與對(duì)照組相比，PRV感染上調(diào)IL－15 mRNA表達(dá)，隨培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)強(qiáng)度先強(qiáng)后弱;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸有加強(qiáng)PRV感染的上調(diào)趨勢(shì)，在6、12、24 h呈現(xiàn)濃度效應(yīng)，其中6 h效果最為明顯。上述結(jié)果提示，蘇氨酸可上調(diào)IL－15 mRNA表達(dá)水平，發(fā)揮其抗病毒感染生物學(xué)效應(yīng)。

TNF－α來源極廣泛，體內(nèi)的多種細(xì)胞均具有產(chǎn)生和釋放TNF－α的能力［29］。隨著研究的深入，TNF－α在抗感染方面的作用受到廣泛關(guān)注，腸道疾病能發(fā)生時(shí)，促炎細(xì)胞因子的生成明顯增加，其中TNF－α是一種重要的炎癥遞質(zhì)，在啟動(dòng)和維持腸組織炎癥中起著非常重要的作用［30］。TNF－α具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，是維持動(dòng)物機(jī)體自穩(wěn)、抵御各種致病因子必不可少的免疫調(diào)節(jié)因子。在低濃度時(shí)，主要作為細(xì)胞自分泌及旁分泌的調(diào)節(jié)物，參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染，促進(jìn)組織修復(fù)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等;在高濃度時(shí)，TNF－α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組與對(duì)照組相比，PRV感染對(duì)TNF－α mRNA的表達(dá)具有較強(qiáng)上調(diào)作用，隨培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)趨勢(shì)先強(qiáng)后弱再強(qiáng);PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸緩解PRV感染的上調(diào)趨勢(shì)，Ⅱ組、Ⅲ組在1、24 h緩解強(qiáng)度大于Ⅰ組，在6 h則表現(xiàn)為緩解強(qiáng)度小于后者，在12 h緩解強(qiáng)度表現(xiàn)為Ⅰ組與Ⅲ組無顯著差異，且小于Ⅱ組。目前發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子包括 IL－1、IL－6 和 TNF－α，其中最重要的促炎細(xì)胞因子是IL－1和TNF－α，本試驗(yàn)結(jié)果提示，補(bǔ)充高水平蘇氨酸可能延緩或阻抑PRV感染IPEC－J2細(xì)胞的炎癥效應(yīng)，這與IL－1β mRNA表達(dá)變化基本一致。

TGF－β在體內(nèi)外具有廣泛的生物學(xué)功能，在維持細(xì)胞增殖、分化和凋亡平衡等方面具有十分重要的作用［31］。TGF－β在其基因家族中研究較為清楚，生長抑制是TGF－β特有的性質(zhì)，TGF－β對(duì)大多數(shù)細(xì)胞的增殖具有抑制作用，尤其是上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和造血細(xì)胞。Moses等［32］通過系統(tǒng)性研究證實(shí)，在正常情況下TGF－β1的作用主要是抑制上皮細(xì)胞增殖。Bai等［33］研究認(rèn)為，TGF－β1 在凋亡蛋白(Fas)/凋亡蛋白配體(FasL)誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著雙重作用，當(dāng)使用TGF－β1和FasL聯(lián)合處理或使用FasL、TGF－β1依次處理后，肺上皮細(xì)胞A549凋亡顯著增強(qiáng);然而，使用TGF－β1延續(xù)持續(xù)處理肺上皮細(xì)胞A549，結(jié)果導(dǎo)致顯著抑制Fas/FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組與對(duì)照組相比，PRV感染后1、6 h對(duì)TGF－β1 mRNA表達(dá)無顯著影響，PRV感染后12、24 h上調(diào)其表達(dá);PRV感染的3組相比，添加高水平蘇氨酸在1 h下調(diào)其表達(dá)且呈濃度效應(yīng)，在6 h對(duì)其表達(dá)無顯著影響，Ⅲ組在12 h表現(xiàn)加強(qiáng)PRV感染后上調(diào)其表達(dá)，Ⅱ組、Ⅲ組在24 h對(duì)PRV感染后上調(diào)表達(dá)有較強(qiáng)的緩解。上述結(jié)果提示，補(bǔ)充高水平蘇氨酸抑制TGF－β1 mRNA表達(dá)，有利于IPEC－J2細(xì)胞增殖，抵抗病毒感染。

4 結(jié)論

補(bǔ)充蘇氨酸對(duì)感染PRV的IPEC－J2細(xì)胞先天性免疫功能具有分子表達(dá)水平的調(diào)控作用，總體上能夠抑制 IL－1β、TNF－α、TGF－β1 基因表達(dá)，加強(qiáng)IL－6、IL－15基因表達(dá)，但影響具有時(shí)間效應(yīng)。致 謝

本試驗(yàn)工作在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，特此感謝郭萬柱教授提供的試驗(yàn)條件及PRV。本試驗(yàn)選用的IPEC－J2細(xì)胞，由丹麥哥本哈根大學(xué)生命科學(xué)院人類營養(yǎng)系Per Torp Sangild教授惠贈(zèng)，特別感謝！

［1］ ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅰ.The inadequacy of diets containing nineteen amino acids［J］.The Journal of Biological Chemistry，1931，94:155 －165.

［2］ MCCOY R H，MEYER C E，ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅷ.Isolation and identification of a new essential amino acid［J］.The Journal of Biological Chemistry，1935，112:283 －302.

［3］ SIMONI R D，HILL R L，VAUGHAN M.The discovery of the amino acid threonine:the work of William C.Rose［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277(37):E25.

［4］ FULLER M F，MILNE A，HARRIS C I，et al.Amino acid losses in ileostomy fluid on a protein－free diet［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1994，59(1):70 －73.

［5］ STOLL B，HENRY J，REEDS P J，et al.Catabolism dominates the first－pass intestinal metabolism of dietary essential amino acids in milk protein－fed piglets［J］.The Journal of Nutrition，1998，128(3):606 －614.

［6］ WANG X，QIAO S Y，LIU M，et al.Effects of graded levels of true ileal digestible threonine on performance，serum parameters and immune function of 10－25 kg pigs［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，129(3/4):264 －278.

［7］ FAURE M，CHONE F，METTRAUX C，et al.Threonine utilization for synthesis of acute phase proteins，intestinal proteins，and mucins is increased during sepsis in rats［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(7):1802－1807.

［8］ REMOND D，BUFFIERE C，GODIN J P，et al.Intestinal inflammation increases gastrointestinal threonine uptake and mucin synthesis in enterally fed minipigs［J］.The Journal of Nutrition，2009，139(4):720 －726.

［9］ SCHIERACK P，NORDHOFF M，POLLMANN M，et al.Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine［J］.Histochemistry and Cell Biology，2006，125(3):293－305.

［10］ NARITA M，KUBO M，F(xiàn)UKUSHO A，et al.Necrotizing enteritis in piglets associated with Aujeszky’s disease virus infection［J］.Veterinary Pathology，1984，21(4):450－452.

［11］ 韓國全.含沙門菌內(nèi)源啟動(dòng)子新型雙功能表達(dá)載體的構(gòu)建及其在豬瘟病毒疫苗研究中的應(yīng)用［D］.博士學(xué)位論文.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［12］ REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.American Journal of Hygiene，1938，27(3):493 －497.

［13］ PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic Acids Research，2001，29(9):e45.

［14］ MONCADAD M，KAMMANADIMINTISJ，CHADEE K.Mucin and Toll－like receptors in host defense against intestinal parasites［J］.Trends in Parasitology，2003，19(7):305 －311.

［15］ BERSCHNEIDER H M.Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl［J］.Gastroenterology，1989，96:A41.

［16］ KAEFFER B，BOTTREAU E，VELGE P，et al.Epithelioid and fibroblastic cell lines derived from the ileum of an adult histocompatible miniature boar(d/d haplotype)and immortalized by SV40 plasmid［J］.European Journal of Cell Biology，1993，62(1):152－162.

［17］ LEONARD R P，SPEER V C.Threonine requirement for reproduction in swine［J］.Journal of Animal Science，1983，56(6):1345 －1353.

［18］ WANG X，QIAO S，YIN Y，et al.A deficiency or excess of dietary threonine reduces protein synthesis in jejunum and skeletal muscle of young pigs［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(6):1442 －1446.

［19］ CASTELLANOS M，CASTILLO J，GARCIA M M，et al.Inflammation－mediated damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33(4):982 －987.

［20］ VAN SNICK J.Interleukin－6:an overview［J］.Annual Review of Immunology，1990，8:253 －278.

［21］ RADDATZ D，BOCKEMUHL M，RAMADORI G.Quantitative measurement of cytokine mRNA in inflammatory bowel disease:relation to clinical and endoscopic activity and outcome［J］.European Journal of Gastroenterology ＆ Hepatology，2005，17(5):547－557.

［22］ TURKAY C，KASAPOGLU B.Noninvasive methods in evaluation of inflammatory bowel disease:where do we stand now?An update［J］.Clinics(Sao Paulo)，2010，65(2):221 －231.

［23］ HIROMATSU T，YAJIMA T，MATSUGUCHI T，et al.Overexpression of interleukin－15 protects against Escherichia coli－induced shock accompanied by inhibition of tumor necrosis factor－alpha－induced apoptosis［J］.Journal of Infectious Diseases，2003，187(9):1442－1451.

［24］ YAJIMA T，NISHIMURA H，ISHIMITSU R，et al.Overexpression of IL－15 in vivo increases antigendriven memory CD8+T cells following a microbe exposure［J］.The Journal of Immunology，2002，168(3):1198－1203.

［25］ RODELLA L，ZAMAI L，REZZANI R，et al.Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells［J］.British Journal of Haematology，2001，115(2):442 －450.

［26］ GRABSTEIN K H，EISENMAN J，SHANEBECK K，et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin－2 receptor［J］.Science，1994，264(5161):965 －968.

［27］ ASHKAR A A，BLACK G P，WEI Q，et al.Assessment of requirements for IL－15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy［J］.The Journal of Immunology，2003，171(6):2937 －2944.

［28］ ASHKAR A A，ROSENTHAL K L.Interleukin－15 and natural killer and NKT cells play a critical role in innate protection against genital herpes simplex virus type 2 infection［J］.Journal of Virology，2003，77(18):10168－10171.

［29］ KAPADIA S，LEE J，TORRE－AMIONE G，et al.Tumor necrosis factor－alpha gene and protein expression in adult feline myocardium after endotoxin administration［J］.Journal of Clinical Investigation，1995，96(2):1042 －1052.

［30］ SU C，SALZBERG B A，LEWIS J D，et al.Efficacy of anti－tumor necrosis factor therapy in patients with ulcerative colitis［J］.The American Journal of Gastroenterology，2002，97(10):2577 －2584.

［31］ MOSES H L，YANG E Y，PIETENPOL J A.TGF－beta stimulation and inhibition of cell proliferation:new mechanistic insights［J］.Cell，1990，63(2):245 －247.

［32］ MOSES H L，ARTEAGA C L，ALEXANDROW M G，et al.TGF beta regulation of cell proliferation［J］.Princess Takamatsu Symp，1994，24:250 －263.

［33］ BAI L，YU Z，WANG C，et al.Dual role of TGF－beta1 on Fas－induced apoptosis in lung epithelial cells［J］.Respiratory Physiology ＆ Neurobiology，2011，177(3):241－246.