萬(wàn)月佳，馬江鋒，徐蓉，賀愛(ài)永，姜岷，陳可泉，姜引

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816

重組大腸桿菌產(chǎn)蔗糖磷酸化酶的酶學(xué)性質(zhì)及其催化合成α-熊果苷

萬(wàn)月佳，馬江鋒，徐蓉，賀愛(ài)永，姜岷，陳可泉，姜引

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816

萬(wàn)月佳, 馬江鋒, 徐蓉, 等. 重組大腸桿菌產(chǎn)蔗糖磷酸化酶的酶學(xué)性質(zhì)及其催化合成 α-熊果苷. 生物工程學(xué)報(bào), 2012,28(12): 1450?1459.

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利用重組大腸桿菌Escherichia coliRosetta(DE3)/pET-SPase發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶 (EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase)。收集的菌體經(jīng)高壓破碎后離心得到粗酶液，通過(guò)鎳NTA親和層析、超濾除鹽后得到電泳純的SPase，純化后的SPase的比酶活是原來(lái)的2.1倍，酶活回收率達(dá)到82.7%。經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定，重組SPase的分子量約為59 kDa。該酶在不高于37 ℃，pH 6.0～6.7的條件下比較穩(wěn)定，最適催化溫度與最適催化pH分別為37 ℃，pH 6.7，該酶對(duì)蔗糖的米氏常數(shù) (Km) 為7.3 mmol/L，最大反應(yīng)速率 (Vmax) 為0.2 μmol/(min·mg)。此外文中還以蔗糖和氫醌為底物，利用重組SPase催化合成α-熊果苷。其最佳反應(yīng)條件為：20%蔗糖，200 U/mL的酶液，1.6%氫醌，pH 6.0～6.5，25 ℃，反應(yīng)21 h。α-熊果苷的摩爾產(chǎn)率為78.3%，α-熊果苷的產(chǎn)量為31 g/L。

重組蔗糖磷酸化酶，純化，酶學(xué)性質(zhì)，α-熊果苷

蔗糖磷酸化酶 (EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase) 屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無(wú)機(jī)磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖[1-2]。該酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖為供體，多類(lèi)物質(zhì)如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷[3]。據(jù)報(bào)道，蔗糖磷酸化酶主要存在于腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides[4]、變異鏈球菌Stococcus mutans[5]、嗜糖假單胞菌Pseudomonas saccharophila[6]、長(zhǎng)雙歧桿菌Bifidobacterium longum[7]、青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis[8]等微生物中，通過(guò)生物發(fā)酵獲得，但由于產(chǎn)量和生產(chǎn)效率都比較低，因此通過(guò)基因工程手段構(gòu)建重組菌株，過(guò)量表達(dá)蔗糖磷酸化酶對(duì)于進(jìn)行工業(yè)化大量生產(chǎn)十分必要。

利用蔗糖磷酸化酶催化合成 α-熊果苷是該酶的重要應(yīng)用之一。α-熊果苷是一種新型的皮膚增白劑，能夠通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性，從而減少黑色素的生成，而對(duì)表皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)以及酪氨酸酶的表達(dá)沒(méi)有影響，并且其美白效果是β-熊果苷10倍以上，是21世紀(jì)最有競(jìng)爭(zhēng)力的美白添加劑之一[9-11]。研究表明，α-熊果苷只能通過(guò)不同的微生物的酶進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)，讓一分子葡萄糖和一分子的氫醌結(jié)合形成[12]。

本文利用重組菌株E.coliRosetta(DE3)/pET-SPase[13]發(fā)酵生產(chǎn)SPase，并對(duì)其進(jìn)行分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，此外還利用該酶以氫醌和蔗糖為底物催化合成 α-熊果苷，其反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 重組SPase催化合成α-熊果苷[14]Fig. 1 Synthesis of α-arbutin catalyzed by recombinant SPase[14].

1 材料與方法

1.1 材料

重組菌E. coliRosetta(DE3)/pET-SPase由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。標(biāo)準(zhǔn)品α-熊果苷購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，K2HPO472 mmol/L，MgSO410 mmol/L，硫胺素0.034 g/L，微量元素 (CaCl2·6H2O 0.74 g/L，ZnSO4·7H2O 0.18 g/L ， MnSO4·H2O 20 g/L ，Na2·EDTA 20.1 g/L，CuSO40.1 g/L，CoCl20.104 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g/L) 2 mL/L。發(fā)酵條件：初始溫度37 ℃，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD600=3時(shí)，連續(xù)流加乳糖 (2 g/(L·h)) 作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

1.2.2 重組蔗糖磷酸化酶的純化

發(fā)酵液離心 (4 ℃，8 000 r/min，15 min) 得到的菌泥用0.5 mol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 6.5) 洗滌并濃縮。濃縮后的菌液經(jīng)高壓破碎后離心(4 ℃，12 000 r/min，30 min) 得到的上清液即為粗酶液。

粗酶液經(jīng)鎳 NTA瓊脂糖凝膠色譜柱，采用含250 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液洗脫，洗脫液用截留分子量為10 kDa的超濾離心管離心脫除咪唑，得到純酶液。

1.2.3 酶的最適溫度的測(cè)定

將純化的重組SPase置于pH 6.7緩沖液中，在不同的溫度 (4 ℃ ～ 45 ℃ ) 下測(cè)定酶活，以活力最高者為100%對(duì)照。

1.2.4 酶的最適pH的測(cè)定

經(jīng)純化的重組SPase在25 ℃條件下，在不同的pH (5.0～9.0) 緩沖液中測(cè)定酶活，以活力最高者為100%對(duì)照。

1.2.5 酶的溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將純化的重組SPase置于pH 6.7緩沖液中，在不同的溫度 (4 ℃～45 ℃) 下保溫1 h，然后測(cè)定其剩余酶活。以活力最高者為100%對(duì)照。

1.2.6 酶的pH穩(wěn)定性的測(cè)定

將純化的重組Spase置于不同的pH (5.5～8.0)下，25 ℃保溫1 h，然后測(cè)定其剩余酶活。以活力最高者為100%對(duì)照。其中pH 5～7為檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH 7～8為Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液，pH 8.5為甘氨酸-NaOH緩沖液。

1.2.7 酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在pH 6.7，50 mmol/L的磷酸緩沖液中分別加入不同濃度的蔗糖 (2～10 mmol/L)，約9 U/mL的酶液，25 ℃反應(yīng)5 min，煮沸終止反應(yīng)，利用高效液相色譜 (HPLC) 分析產(chǎn)物果糖的濃度。

1.2.8 α-熊果苷的合成

式中，M1：初始?xì)漉哪栙|(zhì)量，M2：殘余氫醌的摩爾質(zhì)量，M：生成的α-熊果苷的摩爾質(zhì)量。

1.2.9 酶活力的檢測(cè)

參照Silverstein等[6]的方法，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中釋放的NADPH的量來(lái)計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定體系包括：50 mmol/L的磷酸二氫鉀試劑 (pH 6.7)，140 mmol/L蔗糖溶液，1 mmol/L EDTA-2Na，50 mmol/L MgCl2，1 mg 的 NADP+，l μg 的1,6-二磷酸葡萄糖，100 μg的葡萄糖磷酸變位酶，20 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，20 μL的酶液，總體積為3.3 mL。25 ℃，340 nm測(cè)定NADPH的吸光值的變化。單位酶活的定義為在上述條件下每分鐘消耗1 μmol的NADP+所需的酶量。

1.2.10 蛋白質(zhì)含量以及分子量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Brandford法[15]，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白 (BSA)。

蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)[16]，分離膠濃度為12.5%，染色使用考馬斯亮藍(lán)R-250。

1.2.11 果糖的檢測(cè)

高效液相色譜 (HPLC) 檢測(cè)果糖，檢測(cè)條件：色譜柱為氨基柱 (4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相∶乙腈：水=75∶25，流速為1 mL/min，示差折光檢測(cè)器。

1.2.12 α-熊果苷的檢測(cè)

高效液相色譜 (HPLC) 檢測(cè) α-熊果苷，檢測(cè)條件：色譜柱為戴安 C18 (4.6 mm×250 mm)柱，流動(dòng)相為5%的甲醇，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，流速為0.8 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 蔗糖磷酸化酶的分離純化

在1.2.1的條件下，發(fā)酵產(chǎn)重組SPase的酶活達(dá)到300 U/mL。該重組SPase在N端帶有重組融合的 His-Tag，因此可以采用金屬離子螯合的層析柱純化酶蛋白。將重組SPase離心后進(jìn)行鎳NTA親和層析，然后用超濾離心管脫除咪唑。經(jīng)純化后重組SPase的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明SPase純度較高，并且該重組SPase的分子量約為 59 kDa (包括 4 kDa的組氨酸標(biāo)簽)，與L. mesenteroidesATCC12291產(chǎn)的SPase的分子量接近[17]。蔗糖磷酸化酶的純化倍數(shù)和回收率見(jiàn)表1，通過(guò)金屬離子親和層析和超濾離心除鹽后，SPase的純化倍數(shù)為原來(lái)的 2.1倍，酶活力回收率達(dá)到82.7%。

圖2 重組SPase純化樣品的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant SPase. M: molecular mass markers; 1: crude enzyme; 2:purified SPase.

2.2 pH和溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響

pH和溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖3。結(jié)果表明，酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃；當(dāng)溫度不高于37 ℃時(shí)，重組Spase的酶活力都比較穩(wěn)定，置于相應(yīng)的溫度下1 h仍能保持90%以上的活力，溫度超過(guò)37 ℃后，酶活力損失增加。酶的最適作用pH為6.7；pH在6.0～6.7的范圍內(nèi)，重組 Spase的酶活力都比較穩(wěn)定。該重組 Spase與L. mesenteroidesATCC12291產(chǎn)的SPase的性質(zhì)相似[18]。

表1 重組SPase的純化結(jié)果Table 1 Purif i cation of recombinant SPase

圖3 溫度和pH對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effects of temperature and pH on activities and stabilities of recombinant SPase.: enzyme activity;:enzyme stability.

2.3 重組SPase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本研究在最適反應(yīng)條件下，進(jìn)行了重組SPase對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，并以Michaelis-Menten方程擬合得到重組SPase對(duì)蔗糖的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。通過(guò)雙倒數(shù)作圖法，以r?1對(duì)c?1作圖，結(jié)果如圖 4所示，可得重組 SPase對(duì)蔗糖的米氏常數(shù) (Km) 為7.3 mmol/L，最大反應(yīng)速率 (Vmax) 為 0.2 μmol/(min·mg)。

圖4 重組SPase轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Fig. 4 Kinetics of glucosyl transfer reaction catalyzed by recombinant SPase.

2.4 以蔗糖和氫醌為底物合成α-熊果苷的反應(yīng)條件優(yōu)化

2.4.1 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

重組SPase在溫度不高于37 ℃的條件下，均能保持較高的活力。為此在其他條件不變的情況下，只改變反應(yīng)溫度，觀察其對(duì)氫醌轉(zhuǎn)化率和選擇性的影響，結(jié)果如圖5所示。25 ～℃37 ℃條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率變化不明顯，但是溫度高于25 ℃后，氫醌的選擇性隨溫度升高而下降。此外重組SPase在25 ℃條件下能夠維持較高的酶活力，因此選擇25 ℃進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.4.2 pH對(duì)催化反應(yīng)的影響

重組SPase在pH 6.0～6.7的范圍內(nèi)均能保持較高的活力。為此在其他條件不變的情況下，只改變反應(yīng) pH，觀察其對(duì)氫醌轉(zhuǎn)化率和選擇性的影響，結(jié)果如圖6所示。在pH 6～7條件下，氫醌的轉(zhuǎn)化率比較穩(wěn)定，但pH高于6.5時(shí)，氫醌的選擇性開(kāi)始下降，此外重組SPase在pH 6～6.5條件下能夠維持較高的酶活力，因此選擇pH 6～6.5進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.4.3 氫醌濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

當(dāng)初始蔗糖濃度為500 g/L時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后殘留的蔗糖濃度過(guò)高，不僅造成了原料的浪費(fèi)，而且為以后α-熊果苷的分離帶來(lái)了困難，因此選擇初始蔗糖濃度為 200 g/L，該濃度下對(duì)下游有機(jī)膜超濾分離無(wú)影響。理論上，蔗糖和氫醌合成α-熊果苷的摩爾比為1∶1，但該反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，并且氫醌成本相對(duì)蔗糖高、具有一定的毒性，因此反應(yīng)中應(yīng)使蔗糖過(guò)量，促使氫醌得到最高的轉(zhuǎn)化率。在初始蔗糖濃度200 g/L的條件下，考察不同蔗糖氫醌濃度比對(duì)催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖7所示。隨著蔗糖氫醌濃度比的下降，氫醌的轉(zhuǎn)化率和選擇性均下降，這是由于氫醌濃度越低，蔗糖越過(guò)量，促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，使得氫醌更大程度地轉(zhuǎn)化。因此選擇 1.6%的氫醌 (對(duì)應(yīng)蔗糖與氫醌的摩爾比為4∶1) 進(jìn)行催化反應(yīng)。

圖5 溫度對(duì)生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig. 5 Effect of temperature on production of α-arbutin.

圖6 pH對(duì)生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig. 6 Effect of pH on production of α-arbutin.

圖7 氫醌濃度對(duì)生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig. 7 Effect of concentrations of hydroquinone on production of α-arbutin.

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化反應(yīng)的影響如圖8所示。隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，氫醌的轉(zhuǎn)化率逐漸上升，至21 h轉(zhuǎn)化率基本達(dá)到最大，21 h后轉(zhuǎn)化率變化不明顯，一方面可能是由于反應(yīng)達(dá)到平衡，另一方面可能是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶活力下降，因此將反應(yīng)時(shí)間控制在21 h。

3 討論

圖8 反應(yīng)生成α-熊果苷的進(jìn)程Fig. 8 The process to produce α-arbutin.

SPase作為一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其重要作用在于能夠以蔗糖或 1-磷酸-葡萄糖為供體，多類(lèi)物質(zhì)如多羥基糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成其相應(yīng)的多一個(gè)葡萄糖基的糖苷，因此SPase具有較高的研究?jī)r(jià)值。本文利用自行構(gòu)建的重組E. coliRosetta(DE3)/pET-SPase進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)重組SPase，利用 Ni-NTA柱親和層析來(lái)分離純化重組SPase，純化方法簡(jiǎn)單，得到的重組SPase酶活力較高，且酶活損失較少。同時(shí)對(duì)重組SPase的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并在此基礎(chǔ)上利用該重組SPase以氫醌和蔗糖為底物催化合成 α-熊果苷。在最適條件 (200 U/mL的重組SPase，蔗糖濃度 20% (W/V)，氫醌濃度 1.6%(W/V)，pH 6.0～6.5，25 ℃水浴，避光) 下，氫醌的轉(zhuǎn)化率接近 90%，α-熊果苷的摩爾產(chǎn)率為78.3%，產(chǎn)量達(dá)到31 g/L。與已報(bào)道的其他生產(chǎn)α-熊果苷的方法相比，利用該法生產(chǎn)α-熊果苷的產(chǎn)量高，使用的原料蔗糖和氫醌的量均比較少。

表2 各種合成α-熊果苷方法的比較Table 2 Comparison of α-arbutin synthesis by different methods

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July 4, 2012; Accepted: September 11, 2012

Jiangfeng Ma. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-84172062; E-mail: bioengine@njut.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21076105)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2009CB724701)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。

Properties of sucrose phosphorylase from recombinantEscherichia coliand enzymatic synthesis of α-arbutin

Yuejia Wan, Jiangfeng Ma, Rong Xu, Aiyong He, Min Jiang, Kequan Chen, and Yin Jiang

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing211816,Jiangsu,China

Sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7, Sucrose phosphorylase, SPase) can be produced by recombinant strainEscherichia coliRosetta(DE3)/Pet-SPase. Crude enzyme was obtained from the cells by the high pressure disruption and centrifugation. Sucrose phosphorylase was purified by Ni-NTA aff i nity column chromatography and desalted by ultrafiltration. The specific enzyme activity was 1.1-fold higher than that of the crude enzyme, and recovery rate was 82.7%. The purified recombinant SPase had a band of 59 kDa on SDS-PAGE. Thermostability of the enzyme was shown at temperatures up to 37 °C, and pH stability between pH 6.0 and 6.7. The optimum temperature and pH were 37 °C and 6.7,respectively. TheKmof SPase for sucrose was 7.3 mmol/L, andVmaxwas 0.2 μmol/(min·mg). Besides, α-arbutin was synthesized from sucrose and hydroquinone by transglucosylation with recombinant SPase. The optimal conditions for synthesis of α-arbutin were 200 U/mL of recombinant SPase, 20% of sucrose, and 1.6% hydroquinone at pH 6?6.5 and 25 °C for 21 h. Under these conditions, α-arbutin was obtained with a 78.3% molar yield with respect to hydroquinone, and the concentration of α-arbutin was about 31 g/L.

recombinant sucrose phosphorylase, purification, properties, α-arbutin

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21076105), National Basic Research Program of China (973 Program)(No. 2009CB724701), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.