童武，徐彥召，周艷君，姜一峰，張善瑞，王亞欣，朱建平，虞凌雪，孫晶，陳煥春，童光志

1 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 2002412 華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070

表達O型口蹄疫病毒保護性抗原表位重組PRRSV的構(gòu)建及其鑒定

童武1,2，徐彥召1，周艷君1，姜一峰1，張善瑞1，王亞欣1，朱建平1，虞凌雪1，孫晶1，陳煥春2，童光志1

1 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241
2 華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070

童武, 徐彥召, 周艷君, 等. 表達O型口蹄疫病毒保護性抗原表位重組PRRSV的構(gòu)建及其鑒定. 生物工程學報, 2012,28(12): 1431?1440.

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以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的感染性分子克隆 (rHuN4-F112) 作為載體，將 O型口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的421～480nt (141～160aa) 和598～639nt (200～213aa) 兩優(yōu)勢保護性抗原表位串聯(lián)成的目的基因，通過突變PCR的方法插入Nsp2中的508～532位缺失區(qū)域，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中培養(yǎng)36 h，將上清接種至MARC-145細胞中培養(yǎng)，并在MARC-145細胞中連續(xù)傳代，拯救重組病毒。經(jīng)RT-PCR擴增，MluⅠ酶切及測序驗證，結(jié)果表明插入的外源基因及人為突變的MluⅠ分子標記都正確，說明重組病毒拯救成功，且該重組病毒能夠在MARC-145細胞中穩(wěn)定傳代，將此重組病毒命名為rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能夠在MARC-145細胞上引起明顯的細胞病變，間接免疫熒光檢測表明外源基因在該病毒中成功獲得了表達。經(jīng)過生物學特性分析，該病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL, 且在MARC-145細胞中整體生長速度與其親本病毒rHuN4-F112(△508-532) 相似，但明顯高于rHuN4-F112病毒。

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，O型口蹄疫病毒，感染性分子克隆，重組病毒

口蹄疫 (FMD) 是由口蹄疫病毒 (FMDV)引起的一種烈性傳染病，該病主要感染豬、牛、羊等重要偶蹄動物。由于FMDV的危害性極大，暴發(fā)該病不僅給發(fā)病國家或地區(qū)的畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且還會引起一系列政治和社會問題。FMDV共分為7個血清型，各血清型之間交叉保護性極差，且不同血清型的亞型和分離株間抗原的差異性很大。目前，對于口蹄疫的預(yù)防主要以免疫接種為主，常用口蹄疫疫苗主要有滅活疫苗、合成肽疫苗兩種[1-2]。1982年 Bittle等首次用化學合成的方法，合成FMDV VP1蛋白基因上的第141～160位和200～213位氨基酸短肽免疫動物成功獲得了保護[3]。Morgan等分別采用原核表達的方法，成功表達了FMDV A12株VP1蛋白基因上的第137～168位氨基酸的二聚體及單體，將這2種融合蛋白分別免疫動物，都能成功獲得保護，且二聚體的保護效果較單體好[4]。

豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 引起的以懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，仔豬呼吸道疾病為主要特征的一種傳染病[5-7]。2006年南方大部分省市爆發(fā)的以高致病性PRRSV為主要病原的“高熱病”給我國養(yǎng)豬行業(yè)帶來了巨大的損失[8-12]。由于PRRSV能使豬體產(chǎn)生免疫抑制，PRRSV疫苗和FMDV疫苗同時免疫時，會導(dǎo)致FMDV疫苗免疫失敗，利用PRRSV作為載體開發(fā)新型的PRRS-FMD二聯(lián)疫苗將可以有效解決這一問題。方瑩等在PRRSV感染性分子克隆的基礎(chǔ)上，在Nsp2的非必需區(qū)中插入增強型綠色熒光蛋白(EGFP) 序列，拯救重組病毒，結(jié)果顯示能夠成功拯救出含有EGFP基因的重組病毒，但隨著子代病毒在細胞上的傳代，EGFP基因序列發(fā)生了突變及缺失，進而喪失了EGFP活性[13-16]。徐彥召等在PRRSV HuN4-F112疫苗株的反向遺傳操作平臺的基礎(chǔ)上，選擇抗原性強的NDVNP49基因作為標記基因，成功構(gòu)建了含有標記基因的PRRSV的感染性克隆并拯救出病毒，且拯救出的子代病毒在細胞上能穩(wěn)定地傳代[17-18]。因此，在本實驗中，我們將 FMDV VP1基因上的141～160位和200～213位氨基酸的優(yōu)勢細胞表位經(jīng) (G4S)2串聯(lián)后插入 PRRSV感染性分子克隆rHuN4-F112(508△-532)[19]中的Nsp2缺失區(qū)，希望可以拯救出含有口蹄疫病毒保護性抗原表位的重組PRRSV。

1 材料與方法

1.1 試劑

PRRSV HuN4-F112的感染性分子克隆由本實驗室構(gòu)建[20-21]；抗PRRSV核衣殼 (N) 蛋白的單抗 (鼠源)[22-23]，由本實驗室制備并保存；FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體 (豬源) 由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈；RNeasy Plus Mini Kit試劑盒購自QIAGEN公司，膠回收試劑盒，提質(zhì)粒試劑盒購自上海華舜生物科技有限公司；DpnⅠ，PacⅠ，ClaⅠ，SwaⅠ及T4 DNA連接酶購自NEB公司；FITC標記羊抗鼠 (Alexa Fluor 568) 和羊抗豬 (Alexa Fluor 488) 熒光抗體，RNA轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C reagent購自Invitrogen公司；PfuUItra 11 Fusion HS DNA聚合酶購自Stratagene公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 mMessage High Yield Capped RNA Transcription Kit購自Ambion公司。

1.2 插入FMDV基因片段的引物設(shè)計及目的基因獲得

參照PRRSV F112核苷酸序列，在插入位置兩端設(shè)計了一對鑒定引物P2701和P3192。結(jié)合NCBI中提交部分的FMDV type OVP1基因的全序列，經(jīng)DNAstar軟件比對并輸出共有序列，然后再分別截取共有序列中的 141～160，200～213位氨基酸殘基的核苷酸序列經(jīng) (G4S)2串聯(lián)后共同組成插入的外源基因序列，大小為132 bp。外源基因序列加上插入位置兩端各20 bp組成目的基因序列，大小為172 bp。設(shè)計了OUP1、ODP2、ODP3、ODP4、ODP5五條引物，采用PCR的方法對目的基因進行拼接。引物序列見表1。

1.3 含有外源基因的 rHuN4-F112-ABC(△508-532) 重組質(zhì)粒的獲得

將上述得到的 FMDV外源基因片段采用突變 PCR的方法插到 rHuN4-F112 Nsp2(508△-532)[19]處。突變PCR的反應(yīng)體系：10×PfuUItra 11 反應(yīng)緩沖液 5 μL；dNTPs (10×) 1.25 μL；rHuN4-F112-ABC (508△-532)[19]質(zhì)粒需換算(5～30 ng)；外源基因 1 μL (10 μmol/L 左右)；PfuUItra 11 Fusion HS DNA聚合酶1 μL；補水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：92 ℃2 min；92 10℃ s，55 20℃ s，68 7℃ min 30 s，22個循環(huán)；68 5℃min；4 ℃保存。將突變 PCR反應(yīng)液用DpnⅠ37 ℃酶切6 h，轉(zhuǎn)化至K12感受態(tài)涂含氨芐平板中培養(yǎng)，挑陽性菌測序驗證，并提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 目的基因的擴增引物及鑒定引物Table 1 Primers for amplification and identification of target gene

1.4 含外源基因的rHuN4-F112(△508-532)全長cDNA連接

將上述提取的含 FMDV外源基因片段的rHuN4-F112-ABC (508△-532)[19]質(zhì)粒和rHuN4-F112-DEF[20]質(zhì)粒分別用PacⅠ和ClaⅠ雙酶切后，用華舜的膠回收試劑盒回收相應(yīng)的基因片段，并用 T4 DNA連接酶連接成含外源基因的rHuN4-F112(508△-532)[19]cDNA全長質(zhì)粒。并用SwaⅠ將含外源基因的rHuN4-F112(△508-532)cDNA全長質(zhì)粒線性化。

1.5 重組病毒的體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)染

根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成重組病毒RNA；并參照DMRI-C reagent轉(zhuǎn)染試劑操作說明將轉(zhuǎn)錄合成的 RNA轉(zhuǎn)染至 70%～90%單層的BHK-21細胞中；轉(zhuǎn)染24～36 h取細胞上清液接種至MARC-145細胞，觀察CPE，并連續(xù)傳代[24]。

1.6 rPRRSV-F112-O/VP1ep的鑒定及其生物學特性分析

1.6.1 rPRRSV-F112-O/VP1ep中外源基因及分子標記的鑒定

分別提取拯救病毒的第 3、5、10、15、20代毒的RNA利用鑒定引物P2701、P3192及實驗室保存的MluⅠ鑒定引物進行RT-PCR擴增，將MluRTⅠ-PCR產(chǎn)物用MluⅠ酶切，并電泳觀察結(jié)果；同時把P2701、P3192 RT-PCR反應(yīng)液用P2701引物送公司測序驗證。

1.6.2 間接免疫熒光 (IFA) 鑒定

將拯救病毒的第 5代毒和其親本毒接種MARC-145細胞后48 h后棄培養(yǎng)液。用80%預(yù)冷的乙醇 4 ℃固定 1 h，用 1∶500稀釋的抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體為一抗，以FITC標記羊抗鼠抗體為二抗檢測拯救的重組病毒。同時用1∶180稀釋的FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體孵育1 h，再用FITC標記羊抗豬抗體來反應(yīng)。置熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 rPRRSV-F112-O/VP1ep的TCID50測定

預(yù)先將MARC-145細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層，再將拯救病毒第 5代毒進行10-1～10-10十倍倍比稀釋，分別接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種8孔，最后兩列孔不接毒作對照，置于 37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察CPE，按照Reed-Muench法計算重組病毒的TCID50[24]。

1.6.4 rPRRSV-F112-O/VP1ep的生長曲線測定

以第 5代拯救病毒和其親本毒都以 100個TCID50的毒量接種 MARC-145細胞，分別在接毒后不同的時間點 (12、24、36、48、60、72、84、96 h) 收取細胞上清液，分別進行病毒的TCID50測定，根據(jù)測定結(jié)果繪制成曲線[24]。

2 結(jié)果

2.1 rPRRSV-F112-O/VP1ep全長 cDNA的構(gòu)建

利用引物 (OUP1，ODP2，ODP3，ODP4，ODP5) 進行PCR擴增獲得172 bp的目的基因片段 (圖1)。采用突變PCR的方法獲得了含F(xiàn)MDV type OVP1兩優(yōu)勢表位的重組rHuN4-F112-ABC(508△-532) 的質(zhì)粒，用鑒定引物P2701和P3142鑒定，插入后擴增的片段大小為549 bp (圖2)。用PacⅠ和ClaⅠ雙酶切并拼接成含F(xiàn)MDV type OVP1兩優(yōu)勢表位的全長rHuN4-F112(△508-532)質(zhì)粒。最后用SwaⅠ將該重組的全長質(zhì)粒線性化。

2.2 rPRRSV-F112-O/VP1ep所引起的細胞病變

將線性化好的重組質(zhì)粒根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成重組病毒 RNA；并參照 DMRI-C reagent轉(zhuǎn)染試劑操作說明將轉(zhuǎn)錄合成的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中；轉(zhuǎn)染24～36 h取細胞上清液接種至 MARC-145細胞，連續(xù)傳代，在MARC-145細胞在傳至第2代時就出現(xiàn)了明顯的細胞病變 (圖3)。

圖1 目的基因的獲得Fig. 1 PCR amplification of target gene. M:DL-2000DNA maker; 1: target gene of FMDV; 2: mock.

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid. M:DL-2000DNA maker; 1: size of recombinant plasmid; 2:size of r HuN4-F112-ABC (△508-532); 3: mock.

圖3 rPRRSV-F112-O/VP1ep引起的MARC-145細胞病變Fig. 3 MARC-145 cells infected with PRRSV-F112-O/VP1ep. (A) MARC-145 cells infected with rPRRSV-F112-O/VP1ep virus. (B) Normal MARC-145 cells.

2.3 rPRRSV-F112-O/VP1ep中外源基因及分子標記的鑒定

提取第3、5、10、15、20代rPRRSV-F112-O/VP1ep的 RNA經(jīng) P2701、P3192及MluⅠ鑒定引物進行RT-PCR的擴增，鑒定結(jié)果均成立(圖 4，5)。并將第 3、5、10、15、20代重組病毒的RT-PCR反應(yīng)液送測序，比對結(jié)果證明其外源基因都穩(wěn)定存在 (圖6)。

圖4 拯救病毒的RT-PCR鑒定Fig. 4 Identification of rescued PRRSV by RT-PCR.M: DNA maker DL-2000; 1?5: RT-PCR of rPRRSVF112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th, 15th, 20th passage; 6:RT-PCR of r HuN4-F112(△508-532); 7: mock.

圖5 拯救病毒及野生型病毒的Mlu Ι酶切鑒定Fig. 5 RT-PCR products of rescued virus and wild type virus digested with Mlu Ι. M: DNA marker DL-2000;1?5: RT-PCR of rPRRSV-F112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th,15th, 20th passage digestion with Mlu Ι; 6: RT-PCR of wild type virus digestion with Mlu Ι; 7: mock.

圖6 rPRRSV-F112-O/VP1ep第3、5、10、15、20代毒外源基因測序結(jié)果Fig. 6 Sequence determination of inserts in rPRRSV-F112-O/VP1ep at 3th, 5th, 10th, 15th, 20th passage.

2.4 rPRRSV-F112-O/VP1ep的IFA鑒定

將rPRRSV-F112-O/VP1ep的第 5代毒和其親本毒以100個TCID50的毒量接種MARC-145細胞48 h后棄培養(yǎng)液。都能與1∶500稀釋的抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體結(jié)合，且都出現(xiàn)了特異性的熒光，rPRRSV-F112-O/VP1ep也能與1∶180稀釋的 FMDV typeO VP1 141～160，200～213的多克隆抗體反應(yīng) (圖7)。

圖7 rPRRSV-F112-O/VP1ep及其親本毒的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig. 7 IFA detection of rPRRSV-F112-O/VP1ep and its parental viruses. IFA detection was performed on MARC-145 cells infected respectively, with rHuN4-F112 (A, E), rHuN4-F112(△508-532) (B, F), or rPRRSV-F112-O/VP1ep (C,G) using antibodies against PRRSV N protein (A, B, C, D) or FMDV vp1 protein (E, F, G, H). (D) and (H) are normal MARC-145 cells without infection.

2.5 rPRRSV-F112-O/VP1ep生長滴度測定

將 rPRRSV-F112-O/VP1ep第 5代毒進行10-1～10-10十倍倍比稀釋，接至96孔MARC-145細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種8孔，留兩列作對照，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察CPE，按照Reed-Muench法計算rPRRSVF112-O/VP1ep 的 TCID50=?log10?6.75/0.1 mL。

2.6 rPRRSV-F112-O/VP1ep的生長曲線繪制

以第5代rPRRSV-F112-O/VP1ep和其親本毒都以 100個 TCID50的毒量接種 MARC-145細胞，分別在接毒后不同的時間點收取細胞上清液，分別進行病毒的 TCID50測定，根據(jù)測定結(jié)果繪制成曲線。結(jié)果顯示重組病毒在MARC-145細胞中的生長速度明顯高于其親本毒 (圖 8)。

3 討論

圖8 重組病毒rPRRSV-F112-O/VP1ep及其親本毒在MARC-145細胞上的多步生長曲線Fig. 8 Growth curve detection of rPRRSV-F112-O/VP1ep and its parental viruses on MARC-145 cells.

現(xiàn)今臨床中所用的 FMDV疫苗主要還是滅活疫苗和合成肽疫苗[1-2]，由于PRRSV能使豬體產(chǎn)生免疫抑制，PRRSV疫苗和FMDV疫苗同時免疫時，會導(dǎo)致 FMDV疫苗免疫失敗，利用PRRSV作為載體開發(fā)新型的PRRS-FMD二聯(lián)疫苗也是很有意義的一項研究。Bittle和Morgan等也都分別證實了 FMDVVP1基因上的 141～160位和200～213兩表位是FMDV的主要保護性抗原，能抵抗同源FMDV強毒的攻擊[3-4]。徐彥召等在PRRSV HuN4-F112疫苗株的反向遺傳操作平臺的基礎(chǔ)上，選擇抗原性強的NDVNP49基因作為外源標記基因，成功構(gòu)建了含有外源標記基因的PRRSV的感染性克隆并拯救出病毒，且拯救出的子代病毒中的NP49基因在細胞上能穩(wěn)定地傳代并獲得表達。將含NP49的重組 PRRSV接種實驗豬，能夠抵抗PRRSV強毒的攻擊，且能從豬體內(nèi)檢測到針對NP49的抗體[17-18]。為PRRSV標記疫苗候選株提供了實驗材料，也為本研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的感染性分子克隆 (rHuN4-F112) 作為載體，采用突變PCR的方法將O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的141～160位和200～213位兩保護性抗原表位串聯(lián)后，插入到Nsp2中的508～532位缺失區(qū)域，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中培養(yǎng)36 h，將上清接至MARC-145細胞中連續(xù)傳代，成功拯救出了含 FMDV保護性抗原的重組病毒。且重組病毒中的外源基因能夠在MARC-145細胞中穩(wěn)定傳代并得到表達。為PRRS-FMD二聯(lián)苗提供了候選疫苗株。

本研究驗證了PRRSVNsp2的非必需區(qū)的存在，為PRRSV表達外源基因提供了實驗數(shù)據(jù)，也進一步證明了PRRSV對外源基因的耐受性。為PRRSV標記疫苗的研究提供了理論基礎(chǔ)，同時也為PRRSV二聯(lián)苗的研究提供了新的方向。

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August 9, 2012; Accepted: October 31, 2012

Guangzhi Tong. Tel:+86-21-34293436; Fax: +86-21-54081818; E-mail: gztong@shvri.ac.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2011AA10A208)，國際合作項目 (No. 2010DF33920)，中央科研院所公益性基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費項目 (No. 2011JB03)，國家自然科學基金 (No. 31100121)，NSFC-廣聯(lián)合基金項目 (No. U0931003) 資助。

Construction and identification of a recombinant PRRSV expressing protective antigens of type O foot-and-mouth disease virus

Wu Tong1,2, Yanzhao Xu1, Yanjun Zhou1, Yifeng Jiang1, Shanrui Zhang1, Yaxin Wang1,Jianping Zhu1, Lingxue Yu1, Jing Sun1, Huanchun Chen2, and Guangzhi Tong1

1Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China
2College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,Hubei,China

Using mutation PCR, we cloned the target gene containing 421?480nt (141?160aa) and 598-639nt (200?213aa)ofVP1gene of foot and mouth disease virus (FMDV) into the deleted region (508?532aa) ofNsp2gene of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus derived vaccine strain (HuN4-F112) that was used as vector. The recombinant cDNA wasin vitrotranscribed followed by trancfection of BHK-21 cells for 36 h. Then, the supernatant of the cell culture was continuously seeded to monolayer of MARC-145 cells for recovery of the recombinant virus. CPE was obviously visible after a couple of passages in the seeded MARC-145, and the rescued virus (designated as rPRRSV-F112-O/VP1ep) was identified byMluI digestion, sequencing and immunofluorescence assay. Meanwhile,expression of inserted FMDV epitopes was also detected by indirect immunofluorescence assay with polyclonal antibodies against VP1 protein of FMDV. The analysis of biological characteristics shows that the titer of the rescued recombinant PRRSV (TCID50=?log10?6.75/0.1 mL) was similar to its direct parental virus rHuN4-F112-508△-532, but higher than rHuN4-F112.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), foot and mouth disease virus of type O, infectious cloning, reorganization of virus

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A208 ) , International Sci &Tech Cooperation Program (No. 2010DFB33920), National Nonprofit Institute Research Grant of CATAS-ITBB (No. 2011JB03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100121), NSFC-Guangdong Joint Foundation (No. U0931003).