孫毅凡 李海成 周杰 錢明 陳濤 江勇 賴賽麟 江振友 鐘球 周琳

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的。據報道，2010年全球結核病新增患者約有880萬［1］。我國結核病年發(fā)病人數約為130萬，占全球發(fā)病的14%，位居全球第2位［2］。我國結核病疫情仍很嚴重，因此圍繞研發(fā)保護性疫苗、改進診斷技術一直是結核病基礎研究的熱點。

結核分枝桿菌能分泌大量的免疫原性蛋白，其中由Rv3803c基因編碼的MPT51蛋白，與Ag85復合體有很大程度的同源性［3］，其可能作為有效的保護性抗原在結核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。SodA由結核分枝桿菌Rv3846基因編碼，是一種由致病性分枝桿菌大量分泌的毒力因子，可將宿主巨噬細胞產生的氧自由基轉換為過氧化氫［4］，從而對抗巨噬細胞的氧化攻擊。筆者克隆表達了Rv3803c、Rv3846基因，對其編碼的蛋白 MPT51、SodA進行純化鑒定，為進一步探討相關分泌抗原的輔助診斷價值，構建保護性疫苗及篩選藥物靶點等奠定實驗基礎。

材料和方法

一、菌種和載體

Mtb H37Rv標準菌株為本中心保存，大腸埃希菌（E．coli）TOP10菌株、E．coli Rosetta菌株購自中國Transgen公司，pGEX－6P－1載體（氨芐青霉素抗性，多克隆位點BamHⅠ，EcoRⅠ，SmaⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，NotⅠ）購自美國GE公司。

二、酶和試劑

限制性內切酶、T4連接酶、Pyrobest DNA聚合酶均購自日本TaKaRa公司，谷胱甘肽巰基轉移酶（anti－GST）鼠單抗購自美國Santa Cruse公司，辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的兔抗鼠二抗購自美國promega公 司，異 丙 基－β－D－硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、氨芐青霉素、還原性谷胱甘肽購自鼎國生物公司，Glutathione Sepharose 4B購自美國GE公司，電化學發(fā)光液（electrochemiluminescence，ECL）購自美國Pierce公司。

三、Rv3803c、Rv3846基因重組質粒的構建、表達和純化方法

（一）基因克隆和鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板分別擴增Rv3803c、Rv3846。

Rv3803c上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC－3′； 下游引物：5′－GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG－3′。

Rv3846上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC－3′； 下游 引 物：5′－GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC－3′。

Rv3803c的PCR擴增反應條件：94℃3min，94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 70s，30個循環(huán)；Rv3846的PCR擴增反應條件：94℃3min，94℃30s，62℃1min，72℃1min，30個循環(huán)。

PCR產物經BamHⅠ、XhoⅠ內切酶酶切之后，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，T4連接酶連接到表達載體 pGEX－6P－1，轉化到E．coliTOP10中，送美國Invitrogen公司中國分部測序。

（二）重組質粒的構建和誘導表達

把測序正確的重組質粒轉化到E．coli Rosetta中，準備表達重組蛋白。挑單克隆于5ml含50μg／ml氨芐青霉素的LB（lysogeny broth，溶菌肉湯）培養(yǎng)基中過夜活化培養(yǎng)，第二天以1∶100的體積接種到200ml含50μg／ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600＝0．5～0．6時，加入終濃度為0．4mmol／L的IPTG，16℃誘導培養(yǎng)8h。

（三）重組蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定

1．免疫印跡鑒定：取大約1個A600量（1×109）的菌，超聲破菌（100W 功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進行5min），4℃，20 000g離心15min，分開上清液和沉淀；為了檢測目的蛋白在上清（可溶）還是沉淀（包涵體）中，上清和沉淀分別加入等量的電泳上樣緩沖液，沸水浴煮6min。取5μl進行SDS－PAGE（十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠）電泳。電泳后半干轉膜（15V，45min）。轉印后的PVDF（聚偏氟乙烯）膜用含5%脫脂奶粉的PBS（磷酸鹽緩沖液）室溫封閉1h，anti－GST單抗1∶2000室溫標記1h，HRP偶聯的兔抗鼠二抗1∶5000標記1h，加入ECL液顯影。

2．考馬斯亮藍染色鑒定：純化蛋白和BSA標準品進行SDS－PAGE電泳。電泳后的SDS－PAGE膠用考馬斯亮藍染液過夜染色，然后用脫色液脫色至條帶清晰出現。

3．表達產物的純化：3000g離心10min，收集誘導后的菌體，10ml含2mmol PMSF的PBS重懸，超聲破菌（100W功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進行5min）；4℃，20 000g離心15min，上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠，4℃孵育12h。4℃，500g離心5min收集微珠，用含1%tritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚－100）的PBS液洗3次，最后用含10mmol／L還原性谷胱甘肽的50mmol／L pH8．0的Tris－HCl（三羥甲基氨基甲烷）洗脫蛋白。

結 果

1．Rv3803c、Rv3846基因擴增結果：以 H37Rv為模板，分別擴增得到大約900bp、600bp的基因片段（圖1），與Rv3803c、Rv3846基因的理論值相符。限制性內切酶消化后，連接到pGEX－6p－1載體上，構建pGEX－Rv3803c、pGEX－Rv3846重組質粒。測序后與H37Rv比對顯示：重組質粒Rv3803c、Rv3846編碼基因與H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

圖1 A：Rv3803c基因PCR擴增結果（900bp）；B：Rv3846基因PCR擴增結果（620bp）

2．GST－Rv3803c和 GST－Rv3846重組蛋白在E．coli中表達的可溶性分析：含有重組質粒的E．coli Rosetta用1mmol IPTG 誘導后，超聲破碎菌，20 000g離心15min，分開上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體），等體積加入上樣緩沖液，Western blot鑒定。GST－Rv3803c和 GST－Rv3846兩個重組蛋白在上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體）中的含量大致相等（圖2），故其在E．coli Rosetta中的存在形式均為可溶部分約50%，包涵體形式約50%，相對分子質量分別約為56 000和45 000。

圖2 GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白在E．coli中表達的可溶性分析

3．重組蛋白純化結果鑒定：含有重組質粒的E．coli Rosetta誘導并超聲破碎的上清液與Glutathione Sepharose 4B微珠孵育，親和純化目的重組蛋白。純化后的目的重組蛋白進行考馬斯亮藍染色（圖3A）和 Western blot（圖3B）鑒定。有完整的融合蛋白被純化出來，純化的GST－Rv3803c、GST－Rv3846樣品純度90%以上，但由于GST－Rv3803c純化后降解較嚴重，最終只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST－Rv3803c的濃度大約為0．1mg／ml，完整的GST－Rv3846的濃度大約為0．5mg／ml。相當于每升E．coli Rosetta培養(yǎng)物中，GST－Rv3803c產量為：0．25mg／L、GST－Rv3846產量為1．25mg／L。

圖3 A：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及考馬斯亮藍染色鑒定；B：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及 Western blot鑒定

討 論

近年來，結核分枝桿菌分泌性蛋白的相關研究一直備受關注。目前對多種分泌性蛋白的研究發(fā)現結核分枝桿菌生長期分泌的蛋白，如MPT51、SodA等在結核感染免疫中發(fā)揮了重要作用，為構建保護性疫苗提供了新的思路。

MPT51蛋白的編碼基因是Rv3803c，又稱fbpC1。其相對分子質量約為27 000，是一種非催化性的α／β水解酶，且與Ag85復合體有較高同源性。MiKi等［5］報道，MPT51可在小鼠的脾細胞中介導Ⅰ型細胞免疫。Bethunaickan等［6］以重組Rv3803c為抗原對結核患者IgG、IgA、IgM水平進行檢測，IgG特異度為98%，IgG＋IgA敏感度為71%，均顯著高于健康對照組，具有一定的診斷價值。Siev等［7］發(fā)現，HIV感染和未感染的結核和非結核患者中，抗MPT51的抗體檢測在血清和血漿樣品中顯著相關。此外，MPT51作為候選蛋白在構建疫苗中的免疫學作用也受到關注。Silva等［8］發(fā)現重組MPT51／CpG的DNA疫苗接種能夠為結核感染小鼠模型提供一定的保護作用。Wang等［9］的研究也表明，其在結核感染中發(fā)揮關鍵的保護作用。因此，純化出MPT51，可為進一步探討其輔助診斷價值、構建保護性疫苗等做出必要準備。

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧微生物普遍存在的一種催化超氧自由基轉化為過氧化氫的金屬酶。結核分枝桿菌中有2種SOD，其中SodA由Rv3846基因編碼，對病原體有明顯的保護作用。研究發(fā)現SodA的分泌依賴一種輔助分泌因子Sec2，此種Sec2依賴性的蛋白輸出方式參與某種特異性分泌系統(tǒng)，是結核分枝桿菌逃避宿主Mφ氧化攻擊的毒力機制之一［10］。結核感染動物模型中，降低結核分枝桿菌SOD的產生，可加快單核細胞向肺部浸潤及細胞凋亡，提示SOD在結核致病過程中發(fā)揮重要作用［11］。Khera等［12］發(fā)現表達 SOD 的 DNA 疫苗能產生較高水平的IFN－γ，且保護作用最強。新近文獻報道，SodA在BCG中的過量表達可導致BCG的免疫效力喪失［13］。以上各項結果說明純化鑒定分泌抗原SodA，對深入研究SodA的分子致病機制，探討其作為疫苗候選蛋白的可能性建立了一定的實驗基礎。

本研究以pGEX－6P－1為載體，在E．coli Rosetta菌中誘導表達，其補充了E．coli缺乏的6種稀有密碼子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）對應的tRNA，可明顯提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。采用GST標簽親和層析法成功純化出了GST－Rv3803c和GST－Rv3846蛋白，以期進一步探討結核分枝桿菌分泌性蛋白MPT51、SodA在與宿主巨噬細胞相互作用時，Toll樣受體、細胞凋亡等相關信號通路變化，以及細胞因子相關免疫平衡等分子免疫機制及其在結核防治轉化中的應用。

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