常書福 馬劍英 錢菊英 陳章煒 姚瑞明 葛均波
(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科,上海市心血管病研究所,上海 200032)
冠狀動(dòng)脈斑塊破裂或血栓脫落等引起的冠狀動(dòng)脈微栓塞(coronary microembolization,CME)可導(dǎo)致心肌缺血、壞死,引起重度心律失常、心室收縮功能障礙[1]。本研究采用冠狀動(dòng)脈介入方法建立的豬CME模型,探討CME后Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的變化情況。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡的健康小型家豬12頭,體質(zhì)量21~25 kg,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6頭。
1.2 微栓塞球制備 取直徑42μm的微栓塞球10~15μL(Dyno公司,挪威),放入1.5 mL離心管中,管中再加入1 mL弱0.9%氯化鈉液,顯微鏡下計(jì)數(shù);然后取15萬個(gè)微球放入60 mL離心管中,加入0.9%氯化鈉液配成40~45 mL懸液。每次使用前劇烈震蕩5s,將懸液抽入60 mL注射器內(nèi),然后用5 mL0.9%氯化鈉液沖洗2次。
1.3 動(dòng)物模型建立 肌內(nèi)注射氯胺酮(5 mg/kg),以地西泮(10 mg/kg)和阿托品(0.08 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉后,用3%戊巴比妥維持麻醉。建立耳靜脈通道,滴注0.9%氯化鈉液。分離右側(cè)股動(dòng)脈,置入7F動(dòng)脈鞘,經(jīng)鞘管首劑給予肝素200 U/kg,此后每1 h靜脈注射肝素100 U/kg,維持肝素化。
用數(shù)字減影血管造影儀行冠狀動(dòng)脈造影,送入7F EBU3.5指引導(dǎo)管至左冠狀動(dòng)脈口,確定前降支位置及分布。送入微導(dǎo)管(3.0/2.8F)至前降支中段,經(jīng)微導(dǎo)管將微栓塞球懸液注入前降支內(nèi),再用10 mL0.9%氯化鈉液沖洗微導(dǎo)管并注入冠狀動(dòng)脈內(nèi),制成CME動(dòng)脈模型(研究組)。對(duì)照組則在其前降支注入等量的0.9%氯化鈉液。然后兩組再次行冠狀動(dòng)脈造影。
1.4 樣本采集和分析
1.4.1 樣本采集 1周后靜脈注射30%氯化鉀30 mL,處死CME模型豬,取出心臟,平行于房室溝切塊,前壁、后壁各取5塊質(zhì)量為50~100 mg的心肌組織,液氮冷凍后移入-70℃冰箱,用于RNA及蛋白分析。
1.4.2 蛋白質(zhì)印跡(Western-blot) 取50~100 mg心肌組織,提取蛋白并用二可辛酸(bicinchonininc acid,BCA)法定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳等。TLR4抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。
1.4.3 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction) 取50~100 mg心肌組織,提取其RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;外源性TLR4、內(nèi)參GAPDH均由上海生工公司合成,TLR4引物序列正義鏈及反義鏈分別為5′-CTCTGCCTTCACTACAGAGA-3′和5′-CTGAGTCGTCTCCAGAAGAT-3′,GAPDH引物序列正義鏈、反義鏈分別為5′-TCATCAGCAATGCCTCCTGTACCA-3′和 5′-TATTTGGCAGGTTTCTCCAGACGG-3′。 擴(kuò) 增 方 案:94℃加熱5 min;然后94℃加熱30 s、55℃加熱30 s、72℃加熱30 s,循環(huán)進(jìn)行40次;72℃延伸10 min。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組之間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 心肌組織TLR4蛋白水平 豬心肌組織TLR4蛋白水平見圖1。CME1周后實(shí)驗(yàn)組心肌組織前壁TLR4蛋白水平顯著高于后壁(P<0.05)。而對(duì)照組前壁、后壁TLR4蛋白水平和CME組后壁相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。
圖1 豬心肌組織中TLR4蛋白水平
2.2 心肌組織TLR4 mRNA水平 豬心肌組織TLR4 mRNA水平見表1。CME1周后實(shí)驗(yàn)組心肌組織前壁TLR4 mRNA水平顯著高于后壁(P<0.05);而對(duì)照組前壁、后壁TLR4 mRNA水平與CME組后壁相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1 豬心肌組織中TLR4蛋白水平
CME后會(huì)引發(fā)局灶性心肌微梗死和一過性心肌收縮功能障礙,但1周左右可恢復(fù)[2-3]。由于冠狀動(dòng)脈微血管網(wǎng)豐富,多處心肌壞死可引起局部心肌收縮功能障礙,但這并不是導(dǎo)致心肌收縮功能減弱的主要原因[2]。目前認(rèn)為,炎性反應(yīng)是CME后心功能變化的主要發(fā)生機(jī)制[4]。
TLRs家族在病原體的識(shí)別和激活天然免疫方面發(fā)揮著非常重要的作用。激活的TLRs不僅可以誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答,而且有利于特異性免疫反應(yīng)發(fā)生。TLR4在體內(nèi)分布廣泛,分布于心肌中的TLR4與心血管疾病關(guān)系密切[5]。心力衰竭的病理機(jī)制復(fù)雜,炎性反應(yīng)也參與了這一過程。在心力衰竭的動(dòng)物模型和患者中,TLRs被激活,且其分布形態(tài)發(fā)生了變化。在正常大鼠和人心肌中,TLR4彌散分布,主要分布在心肌內(nèi);而在心力衰竭患者中,TLR4呈局灶性聚集分布[6]。
本研究發(fā)現(xiàn),心肌TLR4表達(dá)在CME1周后顯著升高,而后壁與對(duì)照組前后壁無顯著差異,提示TLR4可能參與了CME后的炎性反應(yīng)。
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