欒兆雙 姚麗麗 傅振寧 宋 娟 胡彩虹

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

早期斷奶造成仔豬營養(yǎng)、環(huán)境和心理應(yīng)激，增加斷奶后仔豬對(duì)環(huán)境潛在病原微生物的敏感性，使仔豬食欲差、消化不良、腹瀉、生長受阻、死亡等，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。腸道是機(jī)體十分重要的防御屏障，仔豬消化道組織和功能發(fā)育尚未成熟，斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的生理、營養(yǎng)和環(huán)境狀況的突然改變易造成其腸道功能紊亂［1］。大量研究表明，斷奶應(yīng)激狀態(tài)下仔豬腸形態(tài)受損，消化吸收能力下降［2－3］。然而關(guān)于早期斷奶引起仔豬腸黏膜屏障變化的報(bào)道還較少，對(duì)于斷奶應(yīng)激引起仔豬腸道損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚［4］。

腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個(gè)病理機(jī)制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)道路的調(diào)節(jié)有關(guān)。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)是 MAPKs家族成員之一，p38 MAPK屬于應(yīng)激活化蛋白激酶，可被促炎因子(如腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素－1)、應(yīng)激刺激(如紫外線、H2O2、熱休克、高滲、蛋白質(zhì)合成抑制劑等)以及脂多糖激活。p38 MAPK信號(hào)通路參與介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞的凋亡和死亡等生理病理過程，并與炎癥調(diào)控反應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)［5－6］。p38 MAPK 是否參與斷奶應(yīng)激引起的仔豬腸道損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目前尚未見報(bào)道。本文研究了早期斷奶對(duì)仔豬腸黏膜屏障的影響，同時(shí)檢測(cè)結(jié)腸黏膜p38 MAPK磷酸化的活化情況，為預(yù)防仔豬早期斷奶應(yīng)激提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取體況相似、胎次和預(yù)產(chǎn)期接近的同品種母豬12窩，產(chǎn)仔數(shù)為9～11頭。仔豬均為“杜×長×大”三元雜交品種。仔豬從7日齡開始誘食并哺乳。在21日齡，每窩選取2～3頭仔豬［平均體重為(5.8±0.4)kg］斷奶后在保育舍飼養(yǎng)，為斷奶組，每窩剩下的仔豬不斷奶繼續(xù)哺乳至35日齡，為哺乳組。仔豬自由采食和飲水，按常規(guī)程序進(jìn)行免疫，試驗(yàn)期為14d。分別于仔豬22、24、28和35日齡屠宰取樣，每次每組6頭。哺乳組和斷奶組在相同的間隔時(shí)間取樣。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照美國NRC(1998)斷奶仔豬的營養(yǎng)需要配制成顆粒飼料?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣品采集與測(cè)定

分別于22、24、28和35日齡，仔豬前腔靜脈取血，肝素抗凝，制備血漿，－80℃保存。然后屠宰仔豬取樣，剖開腹腔，取長度約1 cm的空腸腸段，用生理鹽水將其輕輕沖洗干凈，而后平鋪在濾紙上將液體吸干，浸入10%的福爾馬林中，置4℃冰箱保存，待做組織切片，光鏡分析其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。另取10 cm左右結(jié)腸腸段用剪刀剖開，生理鹽水輕輕沖洗腸內(nèi)容物，濾紙吸干水分，再用手術(shù)刀鈍面輕輕刮取腸黏膜，分裝在5 mL無菌凍存管中，液氮速凍，－80℃保存。

1.3.1 腸形態(tài)分析

用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，中性樹膠封片。Leica Qwin圖像分析儀對(duì)空腸絨毛高度和隱窩深度作定量分析。

1.3.2 血漿D－乳酸含量、二胺氧化酶活性測(cè)定

血漿D－乳酸含量測(cè)定參照Brandt等［7］建立的分光光度法。血漿二胺氧化酶活性分析參照胡泉舟等［8］的方法，用分光光度法測(cè)定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3.3 結(jié)腸黏膜p38 MAPK的活化情況測(cè)定

參考Costantini等［5］的方法。全細(xì)胞裂解液提取結(jié)腸黏膜蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取100 μg樣品加樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂乳粉的0.06%Tween-20的三羥甲基氨基甲烷溶液(TBST)封閉40 min后洗膜，加入相應(yīng)抗體(1∶1 000)4℃過夜孵育，將膜漂洗后加入兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體(1∶1 000)于室溫孵育1 h，最后加入化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑暗室曝光底片。底片掃描后進(jìn)行蛋白條帶的光密度值分析。BCA蛋白定量試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品;全細(xì)胞裂解液、兔抗小鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)和p38 MAPK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記β－肌動(dòng)蛋白(β-actin)的兔抗小鼠IgG抗體購自美國Sigma公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、ECL試劑盒為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。p38 MAPK信號(hào)通路的激活狀況以其磷酸化水平與總水平的比值(p-p38 MAPK/p38 MAPK)來表示，結(jié)果以哺乳組22日齡仔豬p-p38 MAPK/p38 MAPK為參照，斷奶各組p-p38 MAPK/p38 MAPK為相對(duì)于哺乳組22日齡仔豬比值的倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS 6.12中的一般線性模式(GLM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

（2）80和100℃條件下和磺化鉆井液相比較，HTHP失水相差不大，但在120℃高溫條件下HTHP失水相對(duì)偏高，高溫能力不如磺化處理劑；

2 結(jié)果

2.1 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬空腸形態(tài)的影響

由表2可見，與哺乳組相比，斷奶組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度在22、24和28日齡均顯著降低(P＜0.05)，隱窩深度均顯著提高(P＜0.05)，35日齡上述指標(biāo)斷奶組與哺乳組差異不顯著(P＞0.05)。斷奶組在斷奶后的不同時(shí)間腸形態(tài)也發(fā)生了變化，斷奶仔豬24和28日齡空腸絨毛高度/隱窩深度顯著低于22日齡(P＜0.05)，隱窩深度顯著高于22日齡(P＜0.05);35日齡斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于22、24和28日齡(P ＜0.05)。結(jié)果表明，21日齡斷奶使仔豬的腸形態(tài)發(fā)生了較大的變化，斷奶后24 h就引起了仔豬腸絨毛萎縮、隱窩增深，28日齡后逐漸恢復(fù)，至35日齡腸形態(tài)基本恢復(fù)。

表2 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬空腸形態(tài)的影響Table 2 Effects of weaning stress on jejunal morphology of piglets

2.2 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸黏膜通透性的影響

由表3可見，與哺乳組相比，斷奶組血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性在斷奶后不同時(shí)間均顯著提高(P＜0.05)。斷奶組在斷奶后的不同時(shí)間腸黏膜通透性也發(fā)生了變化，斷奶仔豬22、24和28日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性依次提高(P＜0.05)，至35日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性雖不再提高，但是仍顯著高于哺乳組(P ＜0.05)。

2.3 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬p38 MAPK信號(hào)通路的激活

由表4可見，與22日齡斷奶仔豬相比，24日齡p-p38 MAPK/p38 MAPK顯著增加(P＜0.05)，并達(dá)到高峰，隨后此比值隨著日齡的延長逐漸降低。

表3 斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性的影響Table 3 Effects of weaning stress on plasma D-lactate content anddiamine oxidase activity of piglets

表4 斷奶應(yīng)激對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的影響Table 4 Effects of weaning stress on p38 MAPK signal pathway of piglets

3 討論

胃腸道是養(yǎng)分消化吸收的主要場(chǎng)所。小腸是消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位，吸收是小腸絨毛的主要功能，隱窩則具有分泌能力，仔豬小腸黏膜結(jié)構(gòu)的良好狀態(tài)是養(yǎng)分消化吸收和正常生長的生理學(xué)基礎(chǔ)。常用小腸腸絨毛高度降低與升高、隱窩深度增加與減少、絨毛高度與隱窩深度比值大小作為評(píng)價(jià)仔豬發(fā)育和營養(yǎng)水平等的重要指標(biāo)［9］。已有研究報(bào)道，斷奶后仔豬腸絨毛萎縮、脫落，隱窩增生，腸道通透性增加［2－3，10］。本試驗(yàn)證實(shí)了前人結(jié)果。斷奶后仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可造成仔豬腸道消化吸收面積減少，消化能力下降，大量未消化物質(zhì)堆積極易引起異常發(fā)酵，造成腹瀉，最終影響仔豬的生長。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，21日齡斷奶后仔豬腸形態(tài)在1周后逐漸恢復(fù)，至35日齡腸形態(tài)基本恢復(fù)。

二胺氧化酶是哺乳動(dòng)物腸絨毛上皮細(xì)胞的標(biāo)記酶，其活性與絨毛高度和黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)。生理情況下血漿中二胺氧化酶活性很低，在腸黏膜受損時(shí)，由腸黏膜釋放入血的二胺氧化酶使血中含量上升，因此，外周血中二胺氧化酶活性能反映腸上皮細(xì)胞的完整性，可作為反映腸黏膜屏障功能損傷的理想指標(biāo)［8，11］。D－乳酸是胃腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物體內(nèi)不具備將其快速代謝分解的酶系統(tǒng)，當(dāng)腸黏膜生物屏障被破壞時(shí)，腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D－乳酸透過受損的腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，故血漿D－乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損傷的程度和通透性變化［7］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與哺乳組相比，斷奶組血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性在斷奶后不同時(shí)間均顯著提高，說明斷奶應(yīng)激引起仔豬腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬35日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性仍顯著高于哺乳組，而仔豬斷奶后造成的腸形態(tài)損傷在35日齡基本恢復(fù)，說明腸道形態(tài)學(xué)上的恢復(fù)并未使腸上皮的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和功能得到恢復(fù)，腸屏障功能的恢復(fù)滯后于腸形態(tài)的重建。常建星等［12］用大鼠失血性休克模型，研究了休克復(fù)蘇后腸通透性與形態(tài)學(xué)改變的相關(guān)性，也發(fā)現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)下腸屏障嚴(yán)重受損，其通透性的恢復(fù)明顯滯后于形態(tài)學(xué)重建。Prasad等［13］認(rèn)為，腸形態(tài)的恢復(fù)只是腸上皮細(xì)胞重新生長，覆蓋了腸絨毛表面，但正常的功能并未建立，重建的上皮細(xì)胞并未達(dá)到完全成熟，重建后的黏膜表面細(xì)胞所具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)屬性和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同于未損傷的上皮組織。腸黏膜細(xì)胞最初開始修復(fù)階段僅僅是其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的建立，或者只是恢復(fù)了腸上皮細(xì)胞的連續(xù)性，其功能尚未開始恢復(fù)，而最終的修復(fù)不但要求新增殖的細(xì)胞代替損傷的黏膜細(xì)胞，而且還需要細(xì)胞外基質(zhì)的改造及深部細(xì)胞恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能［14－15］。

從細(xì)胞表面信號(hào)到基因表達(dá)所引起的生物學(xué)效應(yīng)過程由多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，對(duì)于斷奶應(yīng)激引起仔豬腸屏障損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚［4］。在多種情況下，蛋白磷酸化是信號(hào)傳遞至終端的重要方式，轉(zhuǎn)錄因子或與其相互作用的上游蛋白常常是磷酸化修飾的直接作用靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個(gè)病理機(jī)制與MAPKs信號(hào)道路的調(diào)節(jié)有關(guān)。p38 MAPK是MAPKs的重要成員之一。已證實(shí)p38 MAPK通路在腸損傷時(shí)被激活，磷酸化水平增加。p38 MAPK通路被激活后，通過磷酸化其底物，直接或間接影響多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，還能激活細(xì)胞內(nèi)一些蛋白激酶，介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)以及促進(jìn)腸損傷后上皮細(xì)胞存活、增殖和修復(fù)過程［5－6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK 通路是腸道上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因素。Broom等報(bào)道［16］，炎癥性腸疾病引起胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、p38 MAPK 被激活，MAPKs激活時(shí)間、程度與腸損傷時(shí)間、程度一致。本研究發(fā)現(xiàn)，斷奶應(yīng)激顯著增加了p-p38 MAPK/p38 MAPK，激活了p38 MAPK信號(hào)通路。

4 結(jié)論

①21日齡仔豬斷奶后腸形態(tài)和腸黏膜屏障受損，雖然仔豬在35日齡腸形態(tài)基本恢復(fù)，但是腸道通透性仍未恢復(fù)，說明仔豬斷奶后腸道通透性的恢復(fù)滯后于形態(tài)學(xué)重建。

②斷奶應(yīng)激激活了p38 MAPK信號(hào)通路。

感謝美國North Carolina State University獸醫(yī)學(xué)院Moeser博士對(duì)本研究選題、構(gòu)思和論文撰寫給予的指導(dǎo)。

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