高 萍 王海峰 方心靈 束 剛 朱曉彤 王松波 王麗娜 江青艷

(華南農業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642)

仔豬斷奶應激是長期困擾養(yǎng)豬生產的一個難題。為此，營養(yǎng)學家試圖通過在斷奶仔豬飼糧中添加外源性物質以緩解斷奶應激，促進仔豬的生長。近年研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸對預防和治療代謝綜合征、胰島素抵抗和癌癥有顯著的效果［1］。一些短鏈脂肪酸對改善腸道環(huán)境、調節(jié)腸道紊亂、治療和預防腸道疾病有重要作用［2］。在動物生產中，脂肪酸作為功能性飼料添加劑目前研究較多的是共軛亞油酸，它在促進動物生長發(fā)育、降低腹脂沉積和改善肉質方面均具有重要的調節(jié)作用［3-5］。

山梨酸(sorbic acid，SA)，學名為 2，4- 己二烯酸(CH3CH=CHCH=CHCOOH)，是一種不飽和直鏈脂肪酸。在飼料工業(yè)上，SA作為酸化劑和防霉劑，具有調節(jié)仔豬胃腸道微生物種群平衡、降低腹瀉率、促進營養(yǎng)物質消化吸收、抑制飼料霉菌生長等作用［1］。另外，SA可通過β氧化的代謝途徑為機體提供能量，且對動物機體無毒副作用［2-3］。鑒于SA具有與共軛亞油酸相似的結構，其是否也具有與共軛亞油酸相似的促進仔豬生長發(fā)育以及調控脂代謝方面的作用均無相關報道。本試驗以純種大約克斷奶仔豬為研究對象，參照共軛亞油酸和普通酸化劑的使用劑量，在基礎飼糧中添加0.050%、0.125%和0.200%的 SA，研究其對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標及相關基因mRNA表達量的影響，旨在為SA在養(yǎng)豬生產中的合理應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的SA均購自寧波王龍科技股份有限公司(食品級，純度為99.0%)。

1.2 試驗設計

試驗選用28日齡純種大約克斷奶仔豬180頭，按組間體重、性別比例一致的原則，將仔豬分成4組，每組3個重復，每個重復15頭豬(8閹公、7母)。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別在每千克基礎飼糧中添加 0.500(0.050%SA 組)、1.250(0.125%SA 組)和 2.000 g(0.200%SA 組)的SA。預試期為7d，35日齡稱仔豬初始重，試驗期為42d。

基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在湖北托佩克種豬有限公司保育舍內進行，飼養(yǎng)欄舍為封閉、漏縫地板式豬舍。豬只自由采食及飲水，按照常規(guī)免疫程序進行免疫接種。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能測定

試驗仔豬分別于35、56和77日齡稱重(上午，空腹)，計算各階段及全期平均日增重;試驗期記錄喂料量和余料量;計算各階段及全期平均日采食量和料重比。

1.4.2 血清生化相關指標測定

在35和77日齡時，每個重復隨機選取6頭仔豬(閹公和母各占1/2)于前腔靜脈采血10 mL，制備血清，-20℃保存，測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量(由廣州達安臨床檢驗中心測定)。在77日齡時，用放射免疫分析法測定血清中胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的含量，試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司。

1.4.3 小腸絨毛形態(tài)測定

在飼養(yǎng)試驗結束當天，每個組隨機選取5頭仔豬(閹割小公豬)進行屠宰。取出十二指腸、空腸和回腸組織各2 cm，經PBS沖洗后，用10%甲醛溶液固定后制成腸道組織切片，在腸道組織切片上選取5～10個典型視野(絨毛平整、走向平直)，觀察腸絨毛和隱窩形態(tài)變化，運用腸道形態(tài)學分析軟件測量腸絨毛高度和隱窩深度，取其平均值作為測定數(shù)據(jù)。對絨毛高度和隱窩深度進行統(tǒng)計，比較絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度的變化。

1.4.4 器官指數(shù)測定

在飼養(yǎng)試驗結束當天，每個組隨機選取5頭仔豬(閹割小公豬)進行屠宰。分別對脾臟、心臟、肝臟和腎臟器官進行稱重，計算器官指數(shù)。

器官指數(shù)(%)=(器官重/體重)×100。

1.4.5 相關基因表達量測定

在飼養(yǎng)試驗結束當天，每個組隨機選取5頭仔豬(閹割小公豬)進行屠宰。采集背最長肌和肝臟樣品，置液氮速凍，-80℃保存，采用TRIZOL一步法提取豬背最長肌和肝臟樣品中的總RNA，總RNA樣品用核酸蛋白測定儀測定其濃度及A260/A280，取0.5 μg 總 RNA 進行 1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性。

取2 μg總 RNA立即用隨機引物和MMLV(Promega公司，USA)進行反轉錄，根據(jù) NCBI中Genbank發(fā)表的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計豬β-肌動蛋白(β-actin)、IGF-Ⅰ和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)基因的上、下游引物(表2)。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

使用標準SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司，日本)。20 μL反應體系:cDNA 模版(RT 產物)1.0 μL，引物(5 μmol/L)0.8 μL，2 × Real-time PCR Master Mix 10.0 μL，DEPC水補至 20.0 μL。PCR反應條件:95℃預變性1 min;95 ℃ 15 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。同時記錄PCR產物解離曲線，檢驗產物的特異性。

以β-actin作為內參基因，對獲得的信號、數(shù)據(jù)進行處理，根據(jù)以下公式計算出目的基因相對于內參基因的比值:2-ΔCt=2-(Ct目的基因-Ct內參基因)，反應體系置Mx3005P型實時定量PCR儀進行，數(shù)據(jù)用相對定量結果顯示，以對照組為1。

表2 豬基因引物序列及擴增參數(shù)Table 2 Gene primer sequences and amplification parameters of pig

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結果以平均值±標準誤表示，用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，生長性能和血清生化指標采用單因素方差分析，并進行Tukey多重比較，小腸絨毛形態(tài)和基因表達采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 飼糧中添加SA對斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可知，0.200%SA組仔豬體重在56和77日齡時顯著高于對照組(P＜0.05);全期平均日增重也顯著高于對照組(P＜0.05);各組間平均日采食量和料重比無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 飼糧中添加SA對斷奶仔豬血清生化相關指標的影響

由表4可知，77日齡時，仔豬血清TP、LDL和IGF-Ⅰ的含量隨SA添加劑量的加大而增加，其中0.200%SA 組顯著高于對照組(P＜0.05);而且在該日齡，血清 ALB、TG和 HDL的含量是0.125%SA組最高，而血清 UN含量是0.050%SA組最低，其中飼糧中添加0.050%和0.125%的SA和對照組相比均能顯著提高血清ALB和HDL 的含量(P ＜0.05)。

2.3 飼糧中添加SA對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)的影響

由表5可知，十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度在0.200%SA組與對照組之間差異均不顯著(P＞0.05)。

2.4 飼糧中添加SA對斷奶仔豬器官指數(shù)的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加0.200%的SA對斷奶仔豬心臟、脾臟、肝臟以及腎臟指數(shù)無顯著性影響(P＞0.05)。

表3 飼糧中添加SA對斷奶仔豬生長性能的影響Table 3 Effects ofdietary SA on growth performance of weaner piglets

表4 飼糧中添加SA對斷奶仔豬血清生化指標的影響Table 4 Effects ofdietary SA on serum biochemical indexes of weaner piglets

表5 飼糧中添加SA對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)的影響Table 5 Effects ofdietary SA on villus morphology of small intestine of weaner piglets

表6 飼糧中添加SA對斷奶仔豬器官指數(shù)的影響Table 6 Effects ofdietary SA on organ indexes of weaner piglets %

2.5 飼糧中添加SA對斷奶仔豬組織基因表達量的影響

由圖1可知，與對照組相比，0.200%SA能降低肌肉PPARγ的mRNA表達量(P＜0.05)，具有促進肝臟IGF-ⅠmRNA表達的趨勢(P=0.058)，但對肝臟中PPARα及肌肉中IGF-Ⅰ mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 飼糧中添加SA對斷奶仔豬組織IGF-Ⅰ和PPARs mRNA表達的影響Fig.1 Effects ofdietary SA on IGF-Ⅰ and PPARs mRNA expression of weaner piglets

3 討論

多不飽和脂肪酸不僅是動物的必需脂肪酸，而且在維持細胞膜的完整性、合成體內脂肪酸衍生物類激素、調節(jié)機體免疫機能、穩(wěn)定糖脂代謝水平和改善腸道發(fā)育方面均具有重要的生物學功能。有研究表明，給斷奶仔豬連續(xù)飼喂7周添加共軛亞油酸的飼糧，仔豬的平均日增重隨共軛亞油酸的添加量增加而呈線性或二次曲線提高［6］。飼糧中添加富含n-3系列多不飽和脂肪酸的魚油和富含n-6系列多不飽和脂肪酸的共軛亞油酸同樣能使斷奶仔豬日增重和飼料轉化效率得到明顯提高［6-7］。本研究結果同樣發(fā)現(xiàn)，在試驗各階段飼糧中添加不同劑量的SA均有提高仔豬平均日增重的趨勢，其中0.200%SA組能顯著提高仔豬平均日增重。而從料重比的結果分析看，0.125%SA組仔豬對飼糧的利用效率最高，隨著劑量增加至0.200%反而有所下降。因此，在生產實踐中SA合理添加劑量可以介于0.125% ～0.200%。上述結果說明SA與其他具有相同共軛結構的直鏈脂肪酸一樣，能調節(jié)動物的生長發(fā)育。

SA提高仔豬的生長性能的具體作用機制還存在爭議。從有機酸制劑的角度來看，飼糧中添加酸制劑主要是通過降低動物腸道里消化物pH、改善消化酶的活性、抑制腸道微生物增殖、減少氨氣和生物胺的產量等多種途徑發(fā)揮作用。王杰等［8］研究表明，飼糧中添加0.2%的復合酸化劑還可以提高斷奶仔豬對粗蛋白質的表觀消化率。另有研究顯示，飼糧中添加0.5%苯甲酸后可以顯著提高斷奶仔豬氮的消化率［9］。Pirgozliev 等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加SA可以降低氮的內源損失，提高氮的表觀代謝能，這可能是由于添加SA提高了蛋白質和氨基酸的消化率，進而改善動物生長性能。但本研究結果表明，在77日齡時，飼糧中添加SA能夠劑量依賴性地提高斷奶仔豬血清TP含量，同時各組ALB含量也較對照組有不同程度地提高，而UN含量有降低的趨勢。該結果說明SA能促進正氮平衡，提高營養(yǎng)素的利用效率。進一步檢測肝臟和肌肉IGF-Ⅰ基因表達水平和血清中含量，結果發(fā)現(xiàn)添加SA均能提高77日齡血清IGF-Ⅰ含量。血液IGF-Ⅰ含量是全身各組織器官分泌IGF-Ⅰ的總體反映，其中以肝臟分泌為主，而肌肉組織亦可表達IGF-Ⅰ，主要以自分泌方式調節(jié)肌肉生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加SA對肌肉IGF-Ⅰ mRNA表達無顯著影響，但對肝臟IGF-Ⅰ mRNA表達具有明顯的促進趨勢。上述結果提示SA可能通過促進肝臟IGF-Ⅰ的分泌，從而促進動物的生長。

血液IGF-Ⅰ含量是反映動物機體生長發(fā)育的重要激素，既受生長軸的精細調控，同時又受到各種營養(yǎng)物質含量的影響。其中脂肪酸，尤其是不飽和長鏈脂肪酸，可以通過其內源性PPARs直接調節(jié)肝臟IGF-Ⅰ的分泌。Lecka-czernik等［11］研究顯示，飼糧中添加羅格列酮(PPARγ的人工合成激動劑)能夠顯著影響大鼠血清IGF-Ⅰ的含量，并且證實是通過PPARγ途徑介導的。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，肝臟PPARα的活性對IGF-Ⅰ分泌也有調節(jié)作用，其中 GW7647(PPARα激動劑)促進IGF-Ⅰ分泌，而GW9622(PPARγ阻斷劑)則抑制其分泌［12］。本研究結果表明，飼糧中添加0.200%SA有上調肝臟IGF-Ⅰ mRNA表達的趨勢，而對肌肉中IGF-Ⅰ mRNA表達豐度則無顯著影響，提示SA的促IGF-Ⅰ分泌作用很可能與肝臟PPARs系統(tǒng)有關。通常PPARs配體在激活或阻斷PPARs以外，還能夠調節(jié)該受體的基因表達水平。Kang等［13］研究發(fā)現(xiàn)順-10，反-12共軛亞油酸能抑制脂肪組織PPARγ的表達水平，從而降低小鼠脂肪沉積。本文研究結果也發(fā)現(xiàn)，SA也可以顯著降低肌肉組織PPARγ mRNA的表達水平，提示SA可能在減少脂肪沉積，改善胴體品質方面同樣具有重要的應用潛能。

另一方面，由于飼糧形態(tài)、飼糧抗原及仔豬本身營養(yǎng)供給的不足，仔豬斷奶過程中腸道形態(tài)和結構往往發(fā)生絨毛萎縮、隱窩加深等退行性變化。有研究表明，某些脂肪酸也可以通過促進胃腸道發(fā)育，改善腸道健康，從而提高仔豬生長性能。Bosi等［14］研究表明，飼糧中添加包被的甲酸鈣顯著提高了仔豬小腸絨毛高度和平均日增重。Jurkowska等［15］報道，飼糧中添加短鏈脂肪酸可以顯著增加遠段空腸及回腸的隱窩深度、絨毛高度和黏膜厚度，顯著降低十二指腸的黏膜厚度。Claus等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加包被的丁酸鹽可增加豬空腸中段皺襞面積。晏家友等［17］研究也表明，二元雜交(大×長)仔豬飼糧中添加以延胡索酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸為主要成分的復合酸化劑，極顯著降低試驗第5周時仔豬的空腸隱窩深度和提高絨毛高度/隱窩深度。但本研究結果并未發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.200%SA對仔豬各腸段的隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度有顯著影響，說明SA對斷奶仔豬的促生長作用可能并非通過促進腸道發(fā)育而實現(xiàn)。

4 結論

①飼糧中添加SA有劑量依賴性提高斷奶仔豬的體重和平均日增重的趨勢，其中以0.125% ～0.200%劑量的效果較好。

②在本試驗條件下，飼糧中添加適宜的SA可提高仔豬血清 TP、LDL、ALB、HDL 和 IGF-Ⅰ的含量，但對小腸黏膜形態(tài)以及脾臟、心臟、肝臟、腎臟器官指數(shù)均無顯著影響。

③飼糧中添加0.200%SA能夠促進斷奶仔豬生長，其作用可能是通過PPARs系統(tǒng)提高血清IGF-Ⅰ的含量而實現(xiàn)的。

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