文 / 萬宇平 趙正苗 田 甜 汪善良 韓京朋

（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

氟喹諾酮（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）類藥物是一系列新型氟取代的喹諾酮類衍生物[1]。FQs又稱吡啶酮酸類藥物，屬于化學(xué)合成抗菌藥。該類藥物對葡萄球菌、肺炎球菌、某些厭氧菌、支原體等均有效，特別是對綠膿桿菌效果好，幾乎適用于臨床常見的各種細(xì)菌感染性疾病[2，3]。喹諾酮類藥物的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，從而影響DNA的正常形態(tài)與功能，阻礙DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)與重組，從而產(chǎn)生快速殺菌作用[4]。

FQs長期使用會(huì)蓄集到動(dòng)物體內(nèi)，從而影響人類的飲食衛(wèi)生與食品安全。隨著FQs的廣泛使用，細(xì)菌耐藥和不良反應(yīng)也相繼發(fā)生，主要有過敏、溢血和腎衰等不良反應(yīng)。此外還有誘發(fā)精神病及癲癇患者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[5，6]。

由于牛奶中的抗生素會(huì)影響牛奶的進(jìn)一步加工，因此許多國家，以及聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）等國際機(jī)構(gòu)都作出規(guī)定：奶牛在接受抗生素治療期間及用藥后數(shù)日內(nèi)擠出的乳汁不得用于生產(chǎn)商品乳[7]。盡管如此，仍有不少農(nóng)場或奶農(nóng)不顧抗生素的危害，不遵守相關(guān)規(guī)定，向乳品加工企業(yè)提供含有抗生素的原奶。因此，對乳品加工企業(yè)來說，抗生素已經(jīng)是原奶收購環(huán)節(jié)必不可少的檢測項(xiàng)目。膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低的特點(diǎn)[8]。本研究以獸醫(yī)臨床上應(yīng)用較廣的FQs作為檢測的目標(biāo)藥物，利用膠體金免疫層析方法實(shí)現(xiàn)了牛奶中多種FQs殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

氯金酸（HAuCl4.4H2O）（分析純，上海化學(xué)試劑有限公司）；恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、達(dá)氟沙星、三聚氰胺、磺胺甲氧異惡唑、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗鼠二抗（Sigma）；硝酸纖維素膜、吸收墊、樣品墊、PVC底板（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；包被抗原（FQs-OVA）、恩諾沙星單抗（自制）；牛奶（市售）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

電子天平FA2104（上海良平儀器儀表有限公司）；磁力攪拌器90-2（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）；低速離心機(jī)L500（湘儀集團(tuán)）；數(shù)控切條機(jī)CT300、連續(xù)式劃膜儀HM8000（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；分光光度計(jì)752S（上海棱光技術(shù)有限公司）；生化培養(yǎng)箱DHP-600（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；LGJ-50C凍干機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；Milli-Q Reference純水儀（美國Millipore）；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（日本島津）。

1.2 膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質(zhì)量百分含量），置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每100 mL的0.01%氯金酸加入2.5 mL的1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌加熱反應(yīng)至液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水[9]。

1.3 金標(biāo)抗體制備

在磁力攪拌下，用0.2 mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7.0，抗體按50～100 μg/mL膠體金的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述FQs單克隆抗體。繼續(xù)攪拌混勻30 min， 加入10%BSA，至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%（體積百分含量），靜置30 min。12000 rpm，4 ℃離心30 min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌2次，用體積為初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的FQs單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物溶液的濃度為50 μg/mL，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微孔試劑制備

向微孔試劑微孔板中加入100 μL FQs單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度為-70 ℃的條件下，預(yù)凍4 h后，再凍干14 h，即可取出，得到凍干有FQs單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑。

1.5 試紙條組裝

用0.01 mol/L，pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液將FQs-OVA偶聯(lián)物稀釋到1 mg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于NC膜上的檢測線（T線），包被量為1 μL/cm；在距離檢測線3 mm處用pH值7.2，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠二抗稀釋到1 mg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C線），包被量為1 μL/cm。包被完畢后將包被好的NC膜置于37 ℃烘干60 min，取出。將樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜依次按順序粘貼在所述底板上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙兩端粘貼有保護(hù)膜，手柄端保護(hù)膜覆蓋在吸水墊上手柄端，反應(yīng)端保護(hù)膜覆蓋在樣品吸收墊的檢測端，在檢測端保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線，用數(shù)控切條機(jī)CT300切割成4 mm寬的試紙條（圖1）。

1.6 免疫層析檢測步驟

1.6.1 使用前將本試劑條和待檢奶樣恢復(fù)至室溫（牛奶樣品必須為均勻液體，不能有結(jié)塊和沉淀）。

1.6.2 從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記（需在1 h內(nèi)使用）。檢測試劑取出后，需立即蓋好試劑桶蓋。

1.6.3 吸取待檢牛奶樣品溶液，用微量移液器移取200 μL于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。

1.6.4 將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中，印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。

1.6.5 室溫（20～25 ℃）孵育5 min后，取出試紙條，判定結(jié)果。

圖1 試紙條組裝模式圖

圖2 檢測結(jié)果判斷

1.7 檢測結(jié)果分析

FQs在樣品中的含量高于等于試劑條對其最低檢測限時(shí)，F(xiàn)Qs單克隆-膠體金標(biāo)記物與FQs結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)被封閉，從而在檢測區(qū)內(nèi)因?yàn)楦偁幏磻?yīng)，不會(huì)與FQs-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣品在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會(huì)在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶（圖2）。具體如下：

陽性：當(dāng)質(zhì)控線（C）顯示一條紅色條帶，而檢測線（T）不顯色，判為陽性；

陰性：當(dāng)質(zhì)控線（C）顯示一條紅色條帶，檢測線（T）同時(shí)也顯示出一條紅色條帶，且檢測線（T）顏色接近或淺于質(zhì)控線（C）時(shí)，判為陰性；

無效：當(dāng)質(zhì)控線（C）不顯示出紅色條帶，則無論檢測線（T）顯示出紅色條帶與否，該試紙條判為無效。

1.8 檢測限試驗(yàn)

取陰性牛奶樣品，分別添加質(zhì)量濃度為0、10、20、40 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品和0、20、40、80 μg/L的依諾沙星、惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)品。所用的稀釋液為pH值為7.2，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液。向微孔試劑中滴加200 μL配制好的標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，孵育5 min后，將試紙插入檢測。

1.9 方法特異性

特異性常用交叉反應(yīng)率表示，是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。將牛奶中常檢的其它藥物：三聚氰胺、磺胺甲氧異惡唑、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素按照500 μg/L的質(zhì)量濃度分別對陰性牛奶進(jìn)行添加。用試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，判斷試紙條的特異性。

1.10 試紙條與液相色譜檢測比對[10]

1.10.1 液相色譜條件

色譜柱：Inertsil C5-3，5 μm，150 mm ×2.1 mm（內(nèi)徑）或相當(dāng)者；流動(dòng)相：0.1%甲酸的乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫（梯度時(shí)間表見表1）；流速：300 μL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：30 μL。

1.10.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測；分辨率：單位分辨率。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)

取陰性牛奶樣品2 份，分別添加質(zhì)量濃度為0、20 μg/L的恩諾沙星，將添加的牛奶各用10 支試紙條進(jìn)行重復(fù)檢測，觀察檢測結(jié)果是否一致。

1.12 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)分為37 ℃加速試驗(yàn)和4 ℃保存試驗(yàn)，將制備好的試紙條置于37 ℃進(jìn)行加速試驗(yàn)，分別在7、14、28、56、112 天取出進(jìn)行檢測，每次3組，每組10 個(gè)平行，分別以質(zhì)量濃度為0、10、20 μg/L的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品添加的陰性牛奶進(jìn)行檢測，觀察顏色的變化。將制備好的試紙條置于4 ℃下進(jìn)行試驗(yàn)，分別在1、3、6、9、12、15 個(gè)月取出進(jìn)行檢測，每次3 組，每組10 個(gè)平行，以質(zhì)量濃度為0、10、20 μg/L的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品添加的陰性牛奶進(jìn)行檢測，觀察顏色的變化。

表1 梯度洗脫條件

圖3 紫外掃描膠體金結(jié)果

圖4 膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)比例確定

圖5 微孔試劑示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金質(zhì)量鑒定結(jié)果

制備好的膠體金外觀純凈、透亮，無沉淀和漂浮物。將膠體金溶液用紫外/可見光分光光度計(jì)在可見光范圍（400～600 nm）掃描，得到單一的吸收峰，最大吸收峰波長為525 nm（圖3）。

2.2 金標(biāo)抗體和微孔試劑

膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水性顆粒，未加抗體或加入的抗體量不足以穩(wěn)定膠體金時(shí)，由于鹽離子效益，加入氯化鈉時(shí)，會(huì)改變膠體金的性質(zhì)，出現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象（圖4）；反之，加入足夠多抗體足以穩(wěn)定膠體金，則不會(huì)發(fā)生聚沉現(xiàn)象。以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，制備金標(biāo)抗體，并加入微孔板中，通過冷阱凍干，制備微孔試劑（圖5）。

2.3 檢測限

結(jié)果顯示：添加0、10 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星和0、20 μg/L的依諾沙星、惡喹酸的牛奶，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；添加20、40 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星和40、80 μg/L的依諾沙星、惡喹酸的牛奶，試紙條質(zhì)控區(qū)顯色，但檢測區(qū)不顯色，呈陽性。

因此，可以認(rèn)為，本試劑條對恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星檢測檢測限為20 μg/L，對依諾沙星、惡喹酸檢測檢測限為40 μg/L。

2.4 特異性

結(jié)果顯示：三聚氰胺、磺胺類藥物、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、四環(huán)素類藥物在500 μg/L濃度時(shí)，試紙條質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)均顯色，可以得出本試劑條未對這些藥物發(fā)生交叉反應(yīng)。

表2 試紙條檢測結(jié)果與儀器方法檢測結(jié)果比較 單位：μg/L

表3 37 ℃加速試驗(yàn)結(jié)果

表4 4℃保存試驗(yàn)結(jié)果

2.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）法比對結(jié)果

抽取陰性牛奶樣品20份，隨機(jī)抽取5份，添加質(zhì)量濃度為20 μg/L的恩諾沙星，分別用本試紙條方法和儀器方法檢測，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，試紙條的檢測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果一致，氟喹諾酮類藥物殘留檢測試紙條的檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

將添加濃度為0μg/L的牛奶用試紙條重復(fù)檢測發(fā)現(xiàn)，試紙條的檢測線均顯色，且深淺大致一致，而添加濃度為20μg/L的牛奶，檢測線均未顯色。試紙條對牛奶樣品檢測的假陽性率和假陰性率均為0，表明本試驗(yàn)制得的試紙條重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性決定試紙條的有效期限。為了檢測試紙條的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行37 ℃加速試驗(yàn)和4 ℃保存試驗(yàn)，其中37 ℃加速試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，4℃保存試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙條在4 ℃條件下可以保存12 個(gè)月。

3 結(jié)論

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，通過肉眼觀察以及紫外掃描，確定所制備的膠體金顆粒均一，平均直徑為40 nm。以膠體金標(biāo)記抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體，建立膠體金免疫層析法快速檢測氟喹諾酮類藥物殘留方法，試紙條對牛奶中恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星檢測檢測限為20 μg/L，對依諾沙星、惡喹酸檢測檢測限為40 μg/L，可用于牛奶中11 種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。該方法能夠滿足日本、歐盟、加拿大和美國對氟喹諾酮類藥物在牛奶中最高殘留限量檢測的要求[11，12]。試紙條檢測線顏色明顯淺于空白對照，通過目測即可直接判定結(jié)果。該方法具有樣品前處理方法簡便，檢測時(shí)間短，靈敏度高的特點(diǎn)，而且與其它藥物無交叉反應(yīng)，特異性良好，假陽性率和假陰性率均為0。經(jīng)LC-MS/MS法驗(yàn)證，試紙條檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。另外，該方法所用試劑均無毒、無污染，可用作牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留檢測的快速定性篩選，但對于陽性結(jié)果需用其它方法進(jìn)一步確認(rèn)。

[1]龐智，鄭細(xì)佛. 氟喹諾酮類抗菌藥物的相互作用及不良反應(yīng). 中國實(shí)用內(nèi)科雜志，1992，12（12）：675-676.

[2]方向群，劉又寧. 新氟喹諾酮類藥物及其在肺部感染中的應(yīng)用. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23（2）：124-126.

[3]汪復(fù). 氟喹諾酮類藥物臨床應(yīng)用進(jìn)展. 中華內(nèi)科雜志，1999，38（1）：65-65.

[4]劉又寧. 氟喹諾酮類藥物的臨床應(yīng)用價(jià)值. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31（10）：722-723.

[5]吳荷芳，王洪澤. 氟喹諾酮類藥物不良反應(yīng)分析. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，19（12）：765-766.

[6]鄧國東，楊桂香，陳杖榴. 氟喹諾酮類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留檢測研究進(jìn)展. 中國獸藥雜志，2000，34（3）：53-58.

[7]郁蓉，王歲樓. 原料奶安全檢測及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，32（6）：289-293.

[8]孔繁德，黃印堯，賴清金. 免疫膠體金技術(shù)及其發(fā)展前景. 福建畜牧獸醫(yī)，2002（21）：42-43.

[9]賀昕，熊曉東，梁敬博，等. 免疫檢測用納米膠體金的制備及粒徑控制. 稀有金屬，2005，29（4）：471-474.

[10]國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì). SNT 1751.2-2007 動(dòng)物源性食品中16 種喹諾酮類藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜 質(zhì)譜法. 2007.

[11]翟宗德，曹程明，葛宇，等. 色譜技術(shù)在牛奶中抗生素殘留檢測方面的應(yīng)用. 食品科學(xué)，2010，31（1）：287-291.

[12]岳振峰，謝麗琪，陳小霞，等. 牛奶中16 種喹諾酮類藥物殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定. 分析測試學(xué)報(bào)，2008，27（3）：240-243.