李 爽,張 艷,姜洪波,杜愛林,徐春陽

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學教研室,2.免疫學教研室,3.三附院,河南新鄉(xiāng) 453003)

小膠質細胞(microglia)在中樞神經系統(tǒng)分布較廣,激活 后參與損傷、炎癥、阿爾茨海默病等許多神經損傷過程,其損失機制尚未完全清楚。白藜蘆醇(resveratrol,Res),是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物,具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血脂癥、抗脂質過氧化等多種活性,已經應用于多種疾病的防治。本實驗通過觀察白藜蘆醇對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活小膠質細胞的影響及小膠質細胞中cdk5表達的變化,來探討白藜蘆醇神經保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

白藜蘆醇、LPS、四氮唑鹽復合物(XTT):美國Sigma公司;兔抗鼠cdk5多克隆抗體(北京博奧森),Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(碧云天)。

1.2 細胞培養(yǎng)

N9小膠質細胞由上海中科院惠贈,采用IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),0.25%的胰酶消化傳代,取對數(shù)期細胞進行實驗。

1.3 XTT法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期的N9細胞,以5×105cells/ml接種于96孔板內,100μ l/well,細胞貼壁培養(yǎng) 24 h后,加藥處理。白藜蘆醇劑量設置為5,10,20,40,80(μ mol/L)單獨或與LPS(1 μ g/ml)共同作用,同時設空白對照。每個濃度設六個平行孔。細胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入50 μ l XTT/PMS混合液,置培養(yǎng)箱中37℃孵育2 h,酶標儀測定450 nm波長處吸光度值(A)。根據下列公式計算細胞平均存活率:存活率 =A藥物處理組/A對照組×100%,實驗重復3次。

1.4 細胞分組

白藜蘆醇最終劑量根據XTT法確定(去除對細胞存活率有明顯影響的白藜蘆醇劑量)。對數(shù)期細胞以5×105cells/ml接種,分為對照組(不施加任何處理)、LPS 組(1 μ g/ml LPS刺激)、白藜蘆醇低劑量+LPS組(5μ mol/L白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜蘆醇中劑量+LPS組(10 μ mol/L白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜蘆醇高劑量+LPS組(20 μ mol/L 白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS 共同作用)。

1.5 倒置相差顯微鏡觀察小膠質細胞形態(tài)學改變

取對數(shù)生長期的N9細胞接種于24孔板內,貼壁培養(yǎng)24 h,加藥處理48 h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化,各組均取板孔正中視野進行觀察。

1.6 小膠質細胞釋放NO含量測定

Griess分析法測定細胞上清液中亞硝酸鹽含量,代表NO含量。取對數(shù)生長期的N9細胞,以5×105cells/ml接種于96孔板內,100μ l/well,細胞貼壁培養(yǎng)24h,加藥處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,取 上清 培養(yǎng)液 50 μ l,轉移到 96 孔板,與 50 μ l的 Griess試劑室溫下反應10 min,570 nm處測定其吸光度值,計算上清液中NO2-含量。

1.7 免疫熒光法檢測cdk5蛋白表達

取對數(shù)生長期的N9細胞做細胞爬片,加藥處理繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用4%多聚甲醛固定15 min,3%BSA封閉20 min,加入兔抗鼠cdk5多克隆抗體(1∶100)4℃過夜,加入Alexa Fluor標記羊抗兔IgG(1∶500),室溫孵育 2 h,抗熒光淬滅封片液封片;倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 白藜蘆醇與LPS對小膠質細胞存活率的影響

本實驗首先采用XTT法分析白藜蘆醇和LPS在實驗條件下對細胞存活率的直接影響,以排除藥物的細胞毒性對模型的干擾。XTT法結果顯示,1μ g/ml LPS作用于N9細胞,與對照組相比,對細胞存活率無明顯影響;5～20μ mol/L濃度范圍內的白藜蘆醇,與對照組比,細胞存活率差別不顯著(P＞0.05,表1)。提示此濃度范圍內的白藜蘆醇對小膠質細胞的毒性相對較低,可用于進一步的實驗研究。因而以下試驗均在此藥物濃度范圍內進行。

Tab.1 Effects of resveratrol and LPS on the cell survival rate of N9 microglia cells(%)

2.2 倒置相差顯微鏡觀察小膠質細胞形態(tài)學改變

結果顯示:LPS(1μ g/ml)處理細胞48 h,與對照組相比,細胞由阿米巴樣或圓形轉變?yōu)楸馄綘睢⒍鄻O桿狀,細胞變得肥大,突起伸長。而中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)與LPS共同作用,對細胞活化形態(tài)有明顯影響,細胞形態(tài)基本恢復到與對照組相同。

2.3 小膠質細胞釋放NO含量

結果顯示:不同濃度白藜蘆醇(5,10,20 μ mol/L)單獨作用于小膠質細胞,對于NO釋放沒有明顯影響(表2)。中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)作用于 LPS激活的小膠質細胞,可顯著抑制LPS激活的小膠質細胞釋放NO(P＜0.01,表3)。

Tab.2 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in N9 cells(μ mol/L)

Tab.3 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in LPS-activated N9 cells(μ mol/L)

2.4 小膠質細胞 cdk5蛋白表達

cdk5蛋白在正常N9細胞低表達,陽性細胞胞質呈綠色(圖1A);LPS激活后,N9細胞高表達 cdk5蛋白,熒光強度增加,且細胞處于活化形態(tài)(圖1B);低濃度白藜蘆醇(5 μ mol/L)與LPS共同作用,對cdk5蛋白表達無明顯影響(圖 1C);中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)與LPS共同作用,可以明顯下調cdk5蛋白表達,且細胞形態(tài)基本恢復(圖1D、E,圖 1見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

N9小膠質細胞株是來源于小鼠的細胞株,其表型與未活化狀態(tài)下小鼠小膠質細胞一致,可很好模擬原代小膠質細胞的特性,該細胞株被廣泛應用于研究小膠質細胞的實驗模型。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌胞壁外膜層的重要組分,在體內和體外研究中被廣泛地用于激活小膠質細胞。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是存在于虎杖等植物中的一種多酚類化合物,具有多方面藥理活性。早已有研究者報道白藜蘆醇具有神經保護作用,但其作用機制尚未明確[1]。本實驗結果表明,LPS作用48 h后,小膠質細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,呈現(xiàn)典型的激活形態(tài),與之前的結果一致[2]。Res與LPS共同作用,能夠明顯抑制細胞形態(tài)的改變,證明其具有抑制小膠質細胞活化的作用。

小膠質細胞過度激活能夠產生NO,而中樞神經系統(tǒng)中過量的NO可通過氧化應激、損傷膜性結構等,導致神經元壞死或凋亡[3]。有研究認為白藜蘆醇能強烈抑制脂多糖激活的巨噬細胞生成NOS,明顯減低細胞胞漿內iNOS蛋白和mRNA的水平[4]。本實驗結果表明,Res與LPS共同作用,能夠明顯抑制小膠質細胞活化所釋放的NO。提示白藜蘆醇的神經保護作用可能與抑制小膠質細胞生成iNOS,減少NO釋放有關。

腦組織中細胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,cdk5)屬于細胞周期素依賴性蛋白激酶(cdks)家族。已有實驗證實,cdk5抑制劑有神經保護作用。而cdk抑制劑也能抑制小膠質細胞激活。據此,本實驗檢測了小膠質細胞上cdk5表達情況。結果表明,LPS刺激小膠質細胞會導致cdk5表達水平上升;而Res與LPS共同作用,則會顯著下調cdk5表達。這提示我們,Res抑制小膠質細胞活化的作用可能與cdk5相關。然而其分子機制和途徑仍不明確。早有研究顯示腦組織中cdk5的活性受[Ca2+]i調節(jié),當[Ca2+]i升高時cdk5的活性增加[5]。另有研究表明,Res能抑制大鼠海馬L-鈣通道,減少[Ca2+]i[6]。有關 Res是否通過下調[Ca2+]i表達而減少cdk5,進而抑制小膠質細胞活化起到保護作用,值得進一步研究。

[1]任俊偉,楊 琴.白藜蘆醇對腦缺血/再灌注氧化應激損傷保護機制的研究進展[J].中國藥理學通報,2011,27(4):448-451.

[2]白群華,李文明,劉洪濤,等.葛根素對脂多糖誘導N9小膠質細胞激活的抑制作用[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26(3):227-230.

[3]Choy C S,Hu C M,Chiu W T,et al.Suppression of lipopolysaccharide-induced of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 by Sanguis Draconis,a dragon's blood resin,in RAW 264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2008,115(3):455-462.

[4]Kim Y A,KimG Y,Park K Y,et al.Resveratrolinhibits nitric oxide and prostaglandin E2 production by lipopolysaccharide-activated C6 microglia[J].J Med Food,2007,10(2):218-224.

[5]Lee M S,Kwon Y T,Li M,et al.Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain[J].Nature,2000,405(6784):360-364.

[6]Li M,Wang Q S,Chen Y,et al.Resveratrol inhibits neuronal discharges in rat hippocampalCA1 area[J].ActaPhysiologica Sinica,2005,57(3):355-360.