白洪波,劉永平,段佳熙,周 勇,孫國瑛,管茶香△

(1.中南大學湘雅醫(yī)學院生理學系,長沙 410008;2.廣州醫(yī)學院生理學教研室,廣州 510182;3.湖南中醫(yī)藥大學生理學教研室,長沙 410208)

氣道上皮是機體抵抗氣源性外部刺激的屏障。氣道上皮的損傷修復與氣道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,在維持氣道穩(wěn)態(tài)中起重要作用。E-鈣粘素(E-cadherin,E-cd)是表達于上皮細胞的重要粘附分子,主要通過同型分子參與介導特定器官或組織同型細胞間的粘附,維持氣道上皮細胞的極性和完整性[1]。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是肺內(nèi)含量豐富的神經(jīng)肽,具有促進支氣管上皮細胞增殖、收縮氣道平滑肌、增加血管通透性和促進黏液分泌等多種效應[2-4]。但CGRP是否通過影響氣道上皮細胞E-cd的表達進而參與氣道損傷后的修復尚未見報道。本研究旨在觀察CGRP對人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)E-cd表達的影響,并探討其信號轉導途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

永生化人支氣管上皮細胞(16HBE14o-細胞株)由美國加州大學舊金山分校Gruenert教授惠贈。DMEM/高糖培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清、青/鏈霉素均為國產(chǎn);DEPC為BBI公司產(chǎn)品,逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTP購自MBI公司,Trizol為Invitrogen Life technologies公司產(chǎn)品、E-cd引物為Takara(大連寶生物)公司產(chǎn)品,DNA Marker為鼎國公司產(chǎn)品。鼠抗人E-cd單克隆抗體和通用型二抗(生物素標記羊抗兔/大鼠/小鼠/豚鼠IgG)為北京中杉公司產(chǎn)品,DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 HBECs培養(yǎng)及實驗分組

將細胞接種至含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基(含青/鏈霉素各 100 U/ml),置于37℃、5%CO2和飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HBECs按以下分組:(1)CGRP預處理量效研究 正常對照組、O3組、CGRP處理組及CGRP預處理+O3組(CGRP濃度分別為10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L);(2)CGRP信號途徑研究正常對照組、CGRP處理組、CGRP+H-89處理組、CGRP+H-7處理組及CGRP+W-7處理組。CGRP濃度為10-8mol/L,H-89、H-7和W-7的終濃度均為10-5mol/L。CGRP預處理2 h后,需進行O3應激的細胞置于含1.5×10-6的O3箱中應激2 h,再放回CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至實驗設計的時間點進行指標檢測。

1.3 免疫細胞化學染色檢測E-cd蛋白的表達

處理后的細胞經(jīng)95%乙醇固定15 min,正常羊血清封閉20 min,抗E-cd單克隆抗體4℃孵育過夜;通用型生物素標記羊二抗于37℃孵育30 min,辣根過氧化物酶標記鏈卵蛋白(S-A/HRP)37℃孵育30 min,DAB顯色。陰性對照為緩沖液取代一抗。將細胞蓋片,在光鏡下觀察,結果判斷:E-cd陽性顯示為明亮的棕黃色顆粒。取相同倍數(shù)(×400)拍攝圖像。將拍攝的照片用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)先進行背景灰度校正,然后統(tǒng)計分析E-cd陽性產(chǎn)物的平均灰度值(系統(tǒng)灰度校正過程中,設置0為純黑、255為純白)。

1.4 RT-PCR檢測E-cd mRNA含量

1.4.1 細胞總RNA的提取及逆轉錄 按試劑盒說明,先提取細胞總RNA,再在20 μ l反應體系中加入總 RNA 1 μ g,25 mmol/L MgCl24 μ l,10×逆轉錄緩沖液2 μ l,RNA 酶抑制劑 0.5 μ l,AMV 逆轉錄酶 15 U,Oligo(dT)Primer 0.5 μ g。反應條件為 :65℃ 5 min,42℃60 min,99℃5 min。逆轉錄產(chǎn)物置-20℃保存。

1.4.2 PCR擴增 E-cd引物序列設計如下:上游:5'-TCC CAT CAG CTG CCC AGA AA-3',下游:5'-TGA CTC CTG TGT TCC TGT TA-3',擴增產(chǎn)物大小502 bp。內(nèi)對照為3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),上游:5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G-3',下游:5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3',擴增產(chǎn)物大小240 bp。PCR反應條件為:95℃5 min預變性,94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán)后72℃5 min。反應體系為 20 μ l:10 ×PCR 緩沖液 2 μ l,25 mmol/L MgCl21.2 μ l,10 μ mol/L 上 、下游引物各 1 μ l,10 mmol/L dNTP 0.4 μ l,Taq DNA 聚合酶 0.4 U。經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)物置4℃保存。

1.4.3 產(chǎn)物分析 取10 μ l擴增產(chǎn)物于 2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠 0.5 μ g/μ l)電泳(100 V,25 min)。電泳后將凝膠置于紫外線燈下,根據(jù)DNA Marker判斷產(chǎn)物,用NIH ImageJ V1.31軟件進行分析,測定面積灰度,以光密度代表其表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 CGRP對正常HBECs E-cd表達的影響

免疫組化染色平均灰度分析顯示,CGRP作用于HBECs 28 h后,棕黃色E-cd陽性產(chǎn)物圍繞HBECs膜呈均勻線狀分布,胞漿內(nèi)少量表達,HBECs膜上E-cd陽性產(chǎn)物隨CGRP濃度升高而增多,與對照組相比差異顯著(P＜0.05,圖 1A,表 1),而胞漿內(nèi)E-cd陽性產(chǎn)物量不隨CGRP濃度變化(P＞0.05,圖1A,表1);RT-PCR實驗結果顯示,CGRP各處理組的HBECs E-cd mRNA相對表達量較對照組均明顯增加(P＜0.05,圖 1B,表 2)。

Fig.1 Effect of CGRP on the expression of E-cd in normal HBECs(n=5)

2.2 CGRP對O3應激后HBECs E-cd表達的影響

免疫組化染色平均灰度分析顯示:與對照組相比,CGRP呈劑量依賴性上調(diào)O3應激后的HBECs E-cd表達(P＜0.05,圖 2A,表 1);胞漿內(nèi)E-cd陽性產(chǎn)物在各濃度CGRP均無明顯改變(P＞0.05,圖2A,表1)。RT-PCR檢測HBECs E-cd mRNA相對表達量與O3應激對照組相比,O3+CGRP處理各組HBECs E-cd mRNA相對表達量均增加(P＜0.05,圖2B,表2)。

Tab.1 Average grave value of E-cd in unstimulated and O3-stressHBECs(±s,n=20)

Tab.1 Average grave value of E-cd in unstimulated and O3-stressHBECs(±s,n=20)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group(plasmalemma)

Normal O3-stress Group Plasmalemma associated E-cd Cytoplasm associated E-cd Plasmalemma associated E-cd Cytoplasm associated E-cd Control 144.443±4.247 107.802±3.214 107.374±3.806 109.423±2.032 CGRP(10-10mol/L) 171.362±3.831** 112.352±3.596 135.747±3.851* 111.421±4.118 CGRP(10-9mol/L) 190.171±4.034** 108.782±4.450 163.601±4.034* 110.514±3.573 CGRP(10-8mol/L) 215.455±2.179** 119.319±3.581 187.268±2.541* 112.548±4.923 CGRP(10-7mol/L) 230.711±2.668** 113.517±2.270 207.691±2.668 117.734±4.417

Tab.2 Relative richness of E-cd mR NA in HBECs(±s,n=20)

Tab.2 Relative richness of E-cd mR NA in HBECs(±s,n=20)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Normal O3-stress Control 0.4747±0.0372 0.4702±0.1251 CGRP(10-10mol/L)0.7085±0.3113* 0.6151±0.0589**CGRP(10-9mol/L)0.8215±0.4901* 0.7282±0.1012**CGRP(10-8mol/L)1.1761±0.2667* 0.9340±0.0438**CGRP(10-7mol/L)1.2538±0.5713* 1.2213±0.2136**

2.3 H-89、H-7和W-7對HBECs E-cd表達的影響

免疫組化染色平均灰度分析顯示,與CGRP處理組相比,CGRP+H-89處理組、CGRP+H-7處理組和CGRP+W-7處理組HBECs膜上E-cd陽性產(chǎn)物均減少(P＜0.05,圖 3A、3B)。RT-PCR結果表明:H-89、H-7和W-7預處理后,E-cd mRNA表達均明顯下降(P＜0.05,圖3C、3D)。

Fig.2 Effect of CGRP on the expression of E-cd in O3-challenged HBECs(n=5)

3 討論

哮喘等氣道疾病常伴有不同程度支氣管上皮細胞結構完整性的破壞和功能受損,后者被認為是哮喘發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)之一[5]。E-cd主要表達于上皮細胞表面,介導細胞間的“同源性細胞粘附”。E-cd的分子結構由細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)組成,其胞漿內(nèi)段與連環(huán)素結合形成復合體,并錨定于肌動蛋白細胞骨架上,使相鄰細胞形成穩(wěn)定連接,參與氣道上皮細胞層的形成和維持[1,6]。當細胞受到有害因素刺激,細胞膜上的E-cd/連環(huán)素復合體發(fā)生酪氨酸磷酸化,E-cd移入胞漿,將導致氣道上皮脫落[6]。本實驗觀察到,正常HBECs中E-cd有較高表達,提示E-cd參與維持正常氣道上皮的完整性。

Fig.3 Effect of H-89,H-7 and W-7 on E-cd expression in HBECs(n=5)

氣道上皮層含有多種肺內(nèi)神經(jīng)肽,能與支氣管上皮細胞的受體結合發(fā)揮作用。本實驗觀察到,CGRP能增加正常 HBECs胞膜 E-cd的表達,對HBECs細胞膜的穩(wěn)定、防止氣道受到外來毒害侵襲、維持氣道穩(wěn)態(tài)具有積極意義。我室前期研究表明[7],O3應激后HBECs膜上E-cd的表達減少,胞漿內(nèi)E-cd表達增加;應激32 h后,HBECs膜上E-cd表達才逐漸增加、胞漿內(nèi)E-cd表達則減少,直至恢復到應激前的水平。本實驗在CGRP預處理后給予O3應激,結果顯示CGRP可劑量依賴性地增加HBECs胞膜E-cd的表達,提示CGRP能夠加速O3應激后HBECs中E-cd表達的動態(tài)變化過程,縮短E-cd表達恢復正常的時間。表明CGRP能加速損傷細胞的修復,有利于氣道上皮局部穩(wěn)態(tài)的恢復和維持。

蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)是細胞內(nèi)信號轉導的重要環(huán)節(jié)。CGRP能通過PKA、PKC和CaM途徑調(diào)控多種細胞的功能[8,9]。本文觀察到PKA阻斷劑(H-89)、PKC阻斷劑(H-7)和CaM阻斷劑(W-7)可從蛋白和基因水平部分逆轉CGRP對HBECs E-cd表達的上調(diào)作用。提示CGRP上調(diào)E-cd表達的細胞內(nèi)信號途徑與PKA、PKC和CaM途徑有關。有關CGRP與E-cd的關系及其在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用值得進一步研究。

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