黃 峰,朱鵬立△,林 帆,林 虹

(1.福建省立醫(yī)院干部特診科,2.福建醫(yī)科大學(xué),福州 350001)

高血壓是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,造成心、腦、腎等靶器官的損傷。臨床及流行病學(xué)研究均證實(shí),長期的高血壓所致的腦損傷造成認(rèn)知功能的逐漸下降[1,2],氧化應(yīng)激與高血壓密切相關(guān)[3]。替米沙坦是特異性血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑,它的降壓作用已得到公認(rèn),而吡哆胺是強(qiáng)效的抗氧化劑。本研究以自發(fā)性高血壓模型鼠為研究對象,通過替米沙坦及吡哆胺單獨(dú)及聯(lián)合治療,觀察干預(yù)前后高血壓大鼠腦組織中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamid adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶p47phox mRNA表達(dá)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平的變化,探討替米沙坦及吡哆胺對自發(fā)性高血壓大鼠腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)措施

22周齡雄性SPF級(jí)別自發(fā)性高血壓大鼠(spon-taneously hypertensive rat,SHR)24只,22周齡雄性SPF級(jí)別維斯塔京都大鼠(wistar-kyoto rats,WKY)6只,均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后,24只SHR隨機(jī)分為4組(n=6):高血壓對照組(hypertension control,HC)每天用蒸餾水2 ml灌胃1次;替米沙坦組(telmisartan,T)每天用6 mg/kg[4]的替米沙坦灌胃1次;吡哆胺組(pridoxamine,P):每天用200 mg/kg[5]的鹽酸吡哆胺灌胃1次;聯(lián)合治療組(telmisartan and pridoxamine TP):每天用6 mg/kg的替米沙坦加上200 mg/kg的鹽酸吡哆胺灌胃1次。WKY作為正常對照組(normal control,NC)每天用蒸餾水2 ml灌胃1次。替米沙坦(Telmisartan)商品名:美卡素,80毫克/片,德國勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字:H20041746。鹽酸吡哆胺(Pridoxamine)美國BIOFER公司產(chǎn)品,貨號(hào):09548CAS-NO:524-367。實(shí)驗(yàn)干預(yù)16周。

1.2 收縮壓測定

各組大鼠每兩周測一次尾動(dòng)脈收縮壓、體重直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。血壓的測量方法:采用智能無創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A(日本軟隆株式會(huì)社),在大鼠清醒狀態(tài)將大鼠放入鼠袋中,保持恒溫,將感應(yīng)器置于大鼠的尾根部,待大鼠安靜后測量尾動(dòng)脈的收縮壓,取測量三次的平均值為收縮壓的結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集和處理

各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),分別稱體重,測尾動(dòng)脈收縮壓,用10%的水合氯醛溶液0.30 ml/100g腹腔麻醉,固定于蛙板上,斷頭取腦,將大腦組織縱向切開,取左側(cè)大腦組織用生理鹽水沖洗,100 mg腦組織置于液氮中保存,備檢NADPH氧化酶p47phox mRNA水平,100 mg腦組織-80℃保存,備檢MDA含量及SOD活性。

1.4 腦組織 MDA、SOD檢測

MDA含量用硫代巴比妥酸法測定,SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程所。

1.5 腦組織中NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)的檢測

取腦組織100 mg左右,采用經(jīng)典方法用Trizol試劑、氯仿和異丙醇進(jìn)行抽提mRNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A Takara公司)的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系 20 μ l,條件為 37℃,15 min,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);85℃,5 s,加熱使反轉(zhuǎn)錄酶失活,反應(yīng)結(jié)束后,將cDNA保存于4℃。使用SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒(DRR081A,TaKaRa)在Thermal Cycler Dice Real Time System(TP800,TaKaRa)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR RT-PCR)。反應(yīng)條件:stage1:預(yù)變性(Repeat 1):95℃,30 s。Stage 2:PCR反應(yīng)(Repeat 40):95℃,5 s;60℃,30 s(熒光信號(hào)采集)。Stage 3:融解曲線分析(Repeat 1):95℃,15 s;60℃,30 s;95℃,15 s(熒光信號(hào)采集)。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出初始模板量,根據(jù)公式(目的基因的表達(dá)量=目的基因定量結(jié)果/管家基因定量結(jié)果)計(jì)算在腦組織中通過管家基因(β-actin)得出的目的基因NADPH氧化酶p47phox的表達(dá)量,進(jìn)行組間比較。從Genbank查獲目的基因NADPH氧化酶p47phox及管家基因β-actin mRNA序列及其登錄號(hào),Real Time PCR引物的設(shè)計(jì)與合成均由大連寶生物公司完成,引物序列見表1。

Tab.1 Sequences for primers

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)前后大鼠血壓和體重情況

實(shí)驗(yàn)過程死亡2只大鼠,故NC組、HC組、T組、P組、TP 組最終分別存活6只、6只、5只、6只、5只。HC組、T組、P組、TP組血壓均明顯高于NC組(P＜0.01);HC組、T組、P組、TP組之間血壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。5組大鼠之間體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。說明選擇動(dòng)物符合實(shí)驗(yàn)要求。藥物干預(yù)16周后,HC組大鼠血壓仍然明顯高于NC組(P＜0.01);T組、TP組在干預(yù)16周后與HC組比較血壓有明顯下降(P＜0.01),但T組與TP組之間血壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);P組血壓未見下降,仍明顯高于NC組(P＜0.01),P組與HC組比較血壓無明顯差異(P＞0.05,表2);干預(yù)治療16周后,各組體重之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05,表2)。說明替米沙坦可以顯著降低SHR的血壓,吡哆胺無降壓作用,兩者聯(lián)合治療未見協(xié)同降壓作用。替米沙坦和吡哆胺不影響大鼠體重。

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

BP:Blood pressure;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine**P＜0.01 vs NC group;# #P＜0.01 vs HC group

Before After Group Systolic BP Weight Systolic BP Weight(mmHg) (g) (mmHg) (g)NC 128.92±5.88 369.25±25.84 122.05±7.29 388.33±22.89 HC 193.50±13.03** 380.00±20.30 193.66±17.72** 393.50±13.63 T 192.42±13.28** 383.10±28.53 99.80±13.28## 393.40±22.62 P 192.67±12.98** 375.08±23.20 195.37±12.98** 390.67±18.31 TP 192.58±14.66** 365.80±20.54 97.00±14.66## 380.70±28.86

2.2 各組大鼠SOD、MDA含量檢測結(jié)果

與NC組比較,HC組腦組織中MDA含量明顯升高、SOD活性明顯減低(P＜0.05);與HC組比較T組、P組、TP組MDA含量明顯減低,SOD活性明顯升高(P＜0.05);MDA含量及SOD活性TP組與T組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);MDA含量TP組明顯低于P組,SOD活性TP組比P組明顯增高(P＜0.05,表3)。說明SHR腦組織中MDA含量升高、SOD活性降低;替米沙坦及吡哆胺治療可以抑制此改變,聯(lián)合治療組在降低MDA含量提高SOD活性方面并不優(yōu)于替米沙坦單藥治療組,但優(yōu)于吡哆胺單藥治療組。

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HC group;△P＜0.05 vs TP group

Group MDA(nmol/L) SOD(U/mg)NC 25.86±3.28 288.94±6.71 HC 57.34±2.49* 198.04±15.56*T 37.69±1.07# 245.85±12.63#P 31.84±1.99#△ 231.83±8.49#△TP 25.86±3.28# 267.57±15.95#

2.3 各組大鼠NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)量檢測結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示管家基因(βactin基因)和目的基因(NADPH氧化酶p47phox基因)都得到較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和融解曲線。各組NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達(dá)量見圖4。與NC組比較HC組NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01);與HC組比較T組和TP組NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01),HC組與P組比較NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05,圖1)。說明SHRNADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)增加,替米沙坦可以顯著抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)水平,但吡哆胺不能抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達(dá)。

Fig.1 NADPH p47phox mRNA relative quantity

3 討論

3.1 氧化應(yīng)激與高血壓腦損傷

大量研究表明氧化應(yīng)激在原發(fā)性高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[3]?；钚匝醮?reactive oxygen species,ROS)是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)自由基。NADPH氧化酶p47phox的激活是ROS的主要來源[6]。SOD活力和MDA含量的可間接反應(yīng)自由基代謝水平[7]。本文觀察到SHR腦組織中MDA含量顯著升高,SOD活性明顯降低,提示自發(fā)性高血壓大鼠腦組織自由基生成增加,清除自由基的抗氧化防御能力下降,腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)可能是高血壓腦損傷的機(jī)制之一。

3.2 替米沙坦對腦損傷的保護(hù)作用

替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑(angiotensinⅡ typeⅠ receptor antagonist,ARB),其降壓作用已得到公認(rèn),替米沙坦是否有降壓以外的靶器官保護(hù)作用。研究結(jié)果表明,當(dāng)ARB與血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體(angiotensinⅡtypeⅠreceptor,AT1)結(jié)合,阻斷血管緊張素Ⅱ(angiontensinⅡ,AngⅡ)與AT1受體結(jié)合,降低NADPH氧化酶的活性[8],減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選用替米沙坦作為干預(yù)藥物,觀察其對腦組織MDA、SOD及NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,替米沙坦治療組血壓明顯下降,并降低腦組織MDA的濃度、提高腦組織SOD活性及抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表達(dá),說明替米沙坦在降低血壓的同時(shí)可以抑制高血壓腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài),其可能機(jī)制是通過阻斷腎素血管緊張素系統(tǒng)而抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達(dá),提示替米沙坦可能具有降壓以外的靶器官保護(hù)作用。

3.3 吡哆胺對腦損害的保護(hù)作用

吡哆胺是維生素B6三種天然形式之一,Mahfouz等研究證明,在體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露在自由基中可導(dǎo)致超氧陰離子和脂質(zhì)過氧化物水平的升高,吡哆胺作為抗氧化劑可減低超氧陰離子和脂質(zhì)過氧化物水平的升高[9],因此吡哆胺是一種自由基清除劑。本研究結(jié)果提示,吡哆胺并不能降低SHR的血壓水平,可以降低腦組織中MDA濃度和增加SOD活性,但不影響腦組織中NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達(dá)。提示吡哆胺無降壓作用但可通過清除自由基改善SHR腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

3.4 聯(lián)合治療對腦損害的保護(hù)作用

單獨(dú)使用替米沙坦和吡哆胺均能改善自發(fā)性高血壓大鼠腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài),聯(lián)合治療進(jìn)一步探討自發(fā)性高血壓大鼠在降壓治療同時(shí)加用抗氧化劑是否能進(jìn)一步改善腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究結(jié)果表明,替米沙坦和吡哆胺聯(lián)合治療在增加SOD活力、降低MDA含量方面優(yōu)于吡哆胺單藥治療,但與替米沙坦單藥治療組比較聯(lián)合治療組并沒有進(jìn)一步改善腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)。替米沙坦組和聯(lián)合治療組在干預(yù)后血壓均明顯下降,而吡哆胺組無降壓作用。說明降壓治療是改善自發(fā)性高血壓大鼠的血壓腦組織大氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)鍵。高血壓腦損害機(jī)制復(fù)雜,加用抗氧化劑吡哆胺未能表現(xiàn)出明顯的協(xié)同改善高血壓腦組織氧化應(yīng)激的作用,其具體機(jī)制值得我們進(jìn)一步研究。

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