張其清 劉玲蓉 李學(xué)敏 袁平 關(guān) （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300192）

1 概述

圍繞國(guó)家重大需求和臨床急需解決的組織病缺損再生修復(fù)、惡性腫瘤高效低毒治療和臨床醫(yī)學(xué)弱信號(hào)采集難等重大科學(xué)問題，將生物醫(yī)用材料研究與物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等相互交叉結(jié)合組織研究。設(shè)計(jì)構(gòu)建了系列生物醫(yī)用材料，研究了材料組成和結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能、效應(yīng)等的相關(guān)性，在引導(dǎo)組織再生（GTR）材料和組織工程支架材料、控緩釋靶向藥物載體和納米生物器件等交叉領(lǐng)域做出了系統(tǒng)性、創(chuàng)造性的貢獻(xiàn)。

2 研究成果

2.1 闡明了膠原基生物醫(yī)用材料在機(jī)體內(nèi)引導(dǎo)組織再生的作用機(jī)制

引導(dǎo)組織再生是指依靠機(jī)械屏障等作用，選擇性地引導(dǎo)細(xì)胞向受損的部位附著、增生，達(dá)到組織修復(fù)的目的。早期使用的聚四氟乙烯膜是一種不能降解的材料，不能被組織吸收，增加了患者第二次創(chuàng)傷的機(jī)會(huì)；天然的膠原材料擁有天然細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性，具有良好生物相容性和降解性，是研究和應(yīng)用最廣泛的生物醫(yī)用材料之一。本項(xiàng)目以天然膠原為主要成分，模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)成分，引入天然多糖殼聚糖（Chi）、透明質(zhì)酸（HyA）和硫酸軟骨素（CS）及羥基磷灰石（HA）等，設(shè)計(jì)制備了用于組織病缺損修復(fù)的GTR膠原膜材料，通過(guò)對(duì)材料組成、結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能、效應(yīng)等的相關(guān)性進(jìn)行深入研究，闡明了材料降解速度與組織再生速度相匹配和選擇性引導(dǎo)受損部位組織再生的作用機(jī)制，為新型功能性GTR材料的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。[1-5]

20世紀(jì)90年代初，我們與國(guó)外同期在國(guó)內(nèi)率先開展了GTR材料的研究，采用酶消化法從哺乳動(dòng)物結(jié)締組織中提取可生物降解膠原并以其為基本原料，通過(guò)涂覆、噴涂或凍干方法成型，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)改性得到膜狀材料。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制交聯(lián)方法（甲醛交聯(lián)、戊二醛交聯(lián)）、交聯(lián)條件（交聯(lián)劑濃度、pH值及交聯(lián)時(shí)間）以及與其他生物材料（天然多糖、PVA等）復(fù)合可調(diào)控膠原膜材料的降解性能、力學(xué)性能和表面性能，從而改善材料的生物學(xué)性能，這為更合理研制組成、結(jié)構(gòu)與性能可調(diào)控，更適合臨床應(yīng)用的GTR材料奠定了基礎(chǔ)。[1，5]本項(xiàng)目在制作小型豬及狗的口腔內(nèi)局限型牙周病缺損模型的基礎(chǔ)上，闡明了膠原膜引導(dǎo)牙周組織再生作用的效應(yīng)及機(jī)制，并通過(guò)口腔種植頰側(cè)造成裂隙狀骨缺損模型研究膠原膜在種植體周圍引導(dǎo)骨再生的效應(yīng)及其作用機(jī)制（見圖1）。[3]上述研究發(fā)現(xiàn)為臨床上喪失功能的牙周組織重建以及骨缺損再生問題提供新的方法和依據(jù)。

利用本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)研發(fā)的BME-10X醫(yī)用引導(dǎo)組織再生膠原膜已獲國(guó)家藥監(jiān)局批號(hào)（國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2005第3640508號(hào)）并推向市場(chǎng)，結(jié)束了我國(guó)該類產(chǎn)品只能依靠進(jìn)口的歷史。該產(chǎn)品在我國(guó)再生醫(yī)學(xué)和骨科、口腔科、整形外科等領(lǐng)域進(jìn)行臨床應(yīng)用，且取得了顯著的臨床效果。

2.2 發(fā)現(xiàn)了膠原基組織工程支架材料組成和結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能的相關(guān)性

本項(xiàng)目模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)將軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分CS、HyA及其結(jié)構(gòu)類似物Chi引入膠原支架制備仿生復(fù)合的多孔軟骨組織工程支架材料；[2]在分析天然骨組織力學(xué)、生物學(xué)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，將膠原與HA、粘多糖-CS、細(xì)胞生長(zhǎng)因子-骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）復(fù)合制備膠原基骨組織工程支架材料；[4，7]采用Chi和PVA對(duì)膠原材料進(jìn)行改性，在碳化二亞氨的活化作用下將粘多糖物質(zhì)CS與膠原基材料結(jié)合制備了組織工程真皮支架材料（見圖2）。[6，8-9]研究發(fā)現(xiàn)了膠原基支架材料組成和結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能的相關(guān)性，研究了材料降解時(shí)限與細(xì)胞生長(zhǎng)速度相匹配等關(guān)鍵科學(xué)問題，闡明了不同支架材料、不同培養(yǎng)條件等對(duì)構(gòu)建組織工程化人工器官的影響，提出了制備組成和結(jié)構(gòu)及理化性能均接近正常軟骨、骨和真皮的新方法，為膠原基支架材料作為組織工程化人工軟骨、骨、皮膚的研究和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

2.3 發(fā)現(xiàn)了生物醫(yī)用材料作為藥物載體實(shí)現(xiàn)高效低毒腫瘤治療的作用機(jī)制

目前，化療是癌癥治療的主要手段之一，但抗腫瘤藥物的選擇性低，不良反應(yīng)嚴(yán)重，甚至不得不中斷化療而延誤治療時(shí)機(jī)。因此，尋找高效低毒的腫瘤治療新策略是臨床迫切需要解決的問題。本項(xiàng)目以天然膠原、天然多糖、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）等作為抗腫瘤藥物載體，解決了控緩釋靶向藥物載體制備的關(guān)鍵科學(xué)、技術(shù)問題，揭示了藥物控緩釋載體在細(xì)胞和組織內(nèi)分布的調(diào)控機(jī)制及其增強(qiáng)藥效的作用機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)高效低毒腫瘤治療提供了方法學(xué)和理論上的依據(jù)及支持。[10-17]

本項(xiàng)目利用膽甾醇、脫氧膽酸、聚乙二醇等物質(zhì)為改性基團(tuán)，對(duì)具有良好生物相容性和生物可降解性的Chi、普魯蘭、可德蘭等天然多糖進(jìn)行雙親性分子設(shè)計(jì)和改性，并制備了其自聚集納米粒，探討了疏水改性多糖及PLA納米粒的自組裝機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，改性多糖納米載體材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)、組成、疏水基團(tuán)取代度、性質(zhì)等的改變可控制納米載體的結(jié)構(gòu)、粒徑大小及分布、CMC、電荷、形態(tài)和穩(wěn)定性等理化性能（見圖 3）；[10-12，14]通過(guò)改變制備條件可調(diào)控PLA納米粒的粒徑大小及分布。[15]以表阿霉素為模型藥物，考察了改性多糖與PLA載藥納米粒載藥、釋藥特性的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變藥載比、初始溶劑、透析速度和相對(duì)分子量等可調(diào)控載藥納米粒的載藥特性；載藥納米粒的載藥量、粒徑、取代度及釋放介質(zhì)的pH值等是調(diào)控載藥納米粒釋藥速度的主要因素。[10-11，13-14]采用膠原為載體，結(jié)合負(fù)載長(zhǎng)春新堿（VCR）的PLGA微球制備了定向控制釋放抗腫瘤藥物系統(tǒng)，通過(guò)改變藥膜的組成和結(jié)構(gòu)可調(diào)控載體的降解速度和藥物的釋放速度，從而達(dá)到緩釋和恒定釋放的效果。[16]

本項(xiàng)目還以表阿霉素、紫杉醇為模型藥物，進(jìn)一步開展了納米藥物載體的體內(nèi)外生物學(xué)評(píng)價(jià)，研究其增強(qiáng)藥效的機(jī)制。分析研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向性藥物載體在細(xì)胞和組織內(nèi)分布的調(diào)控機(jī)制是：①組織導(dǎo)向，通過(guò)控制載藥納米粒的尺寸、電荷等實(shí)現(xiàn)其對(duì)腫瘤部位的被動(dòng)靶向，同時(shí)，可采用葉酸、生物素等導(dǎo)向性分子修飾納米粒，實(shí)現(xiàn)納米粒的主動(dòng)靶向作用；②組織滲透；③細(xì)胞攝取，載藥納米粒主要經(jīng)過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿或溶酶體再釋放藥物，最終以游離藥物的形式進(jìn)入靶細(xì)胞器。載體的靶向性是減小全身毒性反應(yīng)，增強(qiáng)局部藥物效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療高效低毒的主要因素（見圖4）。[13]

2.4 發(fā)現(xiàn)了生物醫(yī)用材料構(gòu)建的納米生物器件提高醫(yī)學(xué)弱信號(hào)采集的新方法

圍繞疾病早期診斷中臨床醫(yī)學(xué)弱信號(hào)采集難的問題，構(gòu)建了納米金陣列和改性電極，發(fā)現(xiàn)了通過(guò)納米金陣列和氨基修飾碳納米材料等改性電極提高多巴胺等檢測(cè)靈敏度的新方法，拓展了生物醫(yī)用材料在納米生物器件研究中的應(yīng)用新領(lǐng)域。

本項(xiàng)目首次成功合成了金納米截角二十面體，揭示了合成不同尺寸、形貌金納米粒的調(diào)控因素及其生長(zhǎng)機(jī)理，為可控合成不同形貌的納米材料提供了一種全新有效的方法（見圖5）。[18]采用溶劑熱法合成了表面氨基修飾的碳納米材料（核-殼結(jié)構(gòu)碳納米顆粒、實(shí)心/空心碳微米管和空心碳球），研究發(fā)現(xiàn)，空心碳微管修飾的金電極在高濃度的抗壞血酸中可選擇性檢測(cè)多巴胺，而碳納米管的空腔結(jié)構(gòu)是造成研究底物氧化-還原行為發(fā)生變化的原因。[19]利用納米金簇對(duì)摻硼金剛石電極改性發(fā)現(xiàn)，改性后的電極檢測(cè)靈敏度可提高至納摩爾級(jí)別，克服了傳統(tǒng)摻硼金剛石電極無(wú)法分辨多巴胺與抗壞血酸氧化特性的缺點(diǎn)，提出了通過(guò)納米金陣列采集海馬神經(jīng)動(dòng)作電位的新方法。[20]

上述本項(xiàng)目研究成果為新型膠原基功能性GTR材料和組織工程支架材料的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用、實(shí)現(xiàn)高效低毒腫瘤治療及合理設(shè)計(jì)、制造納米生物器件提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)于推動(dòng)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展意義重大，對(duì)于經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展產(chǎn)生了重

[1]Q iqing Zhang，Ling-rong Liu，LeiRen，etal.Preparation and characterization ofcollagen-chitosan composites[J].Journalof A pplied Polymer Sciences，1997（64）：2127-2130.

[2]Jihong Y an，X uemin Li，Lingrong Liu，etal.PotentialU se of Collagen-Chitosan-H yaluronan tri-copolymer scaffold for Cartilage Tissue Engineering[J].A rtificial Cell，Blood Substitutes and Immobilization Biotechnology，2006，34（1）：27-39.

[3]Q iqingZhang，K angde Y ao，Lingrong Liu，etal.Evaluation of porous collagen membrane in guided tissue regeneration[J].A rtificial Cell，Blood Substitutes and Immobilization Biotechnology，1999，27（3）:245-253.

[4]Q i-qing Zhang，Lei Ren，Chun W ang，etal.Porous hydroxypatite reinforced w ith collagen protein[J].A rtificialCellBlood Substitutes and Immobilization Biotechnology，1996，24（6）:693-702.

[5]Q iqing Zhang，Lei Ren，Chun W ang，etal.Structure investigation of polyvinyl alcohol-collagen composite[J].Journal M aterials Science&Technology，1997（13）:179-183.

[6]H ongyi Y ang，Q iqing Zhang.Preparation and characterization of collagenG A G s bioactive matrices for tissue engineering[J].Journal of M aterials Science&Technology，2001，17（5）：495.

[7]Lingrong Liu，LihaiZhang，BaizhiRen，etal.Preparation and characterization of collagen-hydroxyapatite composite used forbone tissue engineering scaffold[J].A rtificial Cell， Blood Substitutes and Immobilization Biotechnology，2003，31（4）：435-448.

[8]Zhang lihai，M a dongrui，Zhang qiqing.The modification of scaffold material in building artificial dermis[J].A rtificialCell，Blood Substitutesand Immobilization Biotechnology，2002，30（4）：319-332.

[9]M G uan，L Ren，LP Sun，etal.Potential w ound dressing w ith improved antimicrobial property[J].J A ppl Poly Sci，2007（105）:1679-1686.

[10]W ang Y S，Liu L R，Jiang Q，etal.Self-aggregated nanoparticles of cholesterol-modified chitosan conjugate as a novelcarrier of epirubicin[J].Eur.Polym.J.，2007（43）:43-51.

[11]X indu Y ang，Q iqing Zhang，Y insong W ang，etal.Self-aggregated nanoparticles from methoxy poly（ethylene glycol）-modified chitosan: Synthesis characterization; aggregation and methotrexate release in vitro [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2008（61）：125-131.

[12]W ang Y S， Liu L R， W eng J，etal.Preparation and characterization of self-aggregated nanoparticles of cholesterol-modified O-carboxylmethyl chitosan conjugates[J].Carbohydr.Polym.，2007（69）:597-606.

[13]Y in-song W ang，Q ian Jiang，Rong-shan Li，etal.Self-assembled nanoparticles of cholesterol-modified O-carbosymethyl chitosan as a novel carrier for pacliaxel[J].N anotechnology，2008（19）:101-145.

[14]Fu-Ping G ao，H ui-Zhu Zhang，Ling-Rong Liu，etal.Preparation and physicochemical characteristics of self-assembled nanoparticles of deoxycholic acid modified-carboxymethyl curdlan conjugates [J].Carbohydrate Polymer，2008，71（1）:606-613.

[15]M in Liu，Zhimin Zhou，X iaofeng W ang，etal.Formation of poly（l，d-lactide） spheres w ith controlled size by direct dialysis[J].Polymer，2007（48）:5767-5779.

[16]H ongli Chen，H an Chen，Lingrong Liu，etal.The study of improved controlled release of vincristine sulfate from collagen-chitosan complex film[J].A rtificial Cells，Blood Substitutes and Immobilization Biotechnology，2008（6）:372-385.

[17]K angde Y ao，Tao Peng， Q iqing Zhang ，etal.pH—dependent hydrolysis and drug release of chitosan/polyetherinterpenetrating polymernetw ork hydrogel[J].Polymer international，1994（34）：213-219.

[18]Jun X u，Siyue Li，Jian W eng，etal.H ydrothermal syntheses ofgold nanocrystals:from icosahedral to its truncated Form[J].A dvanced Functional M aterials，2008，18（2）：277-284.

[19]X iaofeng W ang，X iaoqing Liu， Linfei Lai， etal.Syntheses，properties and electrochemical activity of carbon microtubesmodified w ith amino groups[J].A dvanced Functional M aterials，2008（18）：1809-1823.

[20]Jian W eng，Junmin X ue，John W ang，etal.G old cluster sensors formed electrochemically at boron-doped diamond electrodes:detection ofdopamine in the presence of ascorbic acid and thiols[J].A dvanced Functional M aterials，2005，15（4）：639-647.