宋賀，徐新超，王敬國，陳清，郭景恒，王進闖

(中國農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，農業(yè)部植物營養(yǎng)學重點實驗室，北京 100193)

生物反硝化過程是農田氮素損失的重要途徑［1］，它產(chǎn)生的N2O、NO等氣體會對臭氧層產(chǎn)生危害［2-3］，并會產(chǎn)生一定的溫室效應［4］。該過程受到氧分壓、含水量、有機碳和含量等因素的影響［5-6］。農田管理措施中，灌溉會通過增大土壤的含水量，改變土壤通氣狀況和氧分壓影響反硝化過程。當土壤孔隙含水量超過60%時，反硝化過程會受到強烈的影響［7］。施肥則是通過為反硝化微生物提供能源、電子供體和底物來影響反硝化過程［8］?？偟膩碚f，水肥投入將會促進反硝化過程的進行［9-10］。

農業(yè)實踐中，常會給菜田特別是設施菜田投入過量的水肥。隨著種植結構的調整，設施蔬菜種植已逐漸成為我國蔬菜的主導產(chǎn)業(yè)，其種植面積已從上個世紀八十年代初的0.7萬公頃，增加到了2008年的334.7萬公頃，增加了近500倍［11-12］。但大部分的設施菜田，每年化肥氮和有機肥的投入量多會超過每公頃1200 kg和10 t，灌溉量也常會超過1000 mm［13-15］。過量的有機碳、氮和水投入，將促進反硝化的進行，增大 N2O、NO等氣體的排放。Ryden和Lund研究發(fā)現(xiàn)，菜田的反硝化損失可高達14%～52%，而N2O排放則占整個反硝化損失的13% ～20%［1］。在這種長期的大水大肥高投入的條件下，整個土體的反硝化特征，比如反硝化潛勢等可能會發(fā)生改變，不同土層之間的反硝化特征也可能會存在差異。

目前對反硝化潛勢等特征的研究多集中在糧田的表層土壤［16-17］，對設施菜田不同土層土壤研究較少。在設施菜田中，除了表層土壤進行反硝化外，底層土壤也可能會進行反硝化，因為高投入的碳、氮會淋洗到底層，為反硝化微生物提供底物。忽略對下層土壤的研究可能會低估土壤氮素的反硝化損失。此外，現(xiàn)在對氮素反硝化的研究，多采用田間表層通量研究，很少與剖面觀測同步，這可能會低估反硝化產(chǎn)物量，因為表層土壤除了向空氣中排放N2O和NO等氣體外，還可能同時會向底層土壤擴散。

國內外研究反硝化過程的方法，多數(shù)是采用乙炔抑制法和示蹤法，這些方法在一定條件下為研究反硝化過程提供了有效途徑，但它們一般不能連續(xù)恒壓檢測，且無法準確地定量N2，從而很難精確追蹤反硝化過程。本研究采用引進的自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng))進行相關研究［18］。該系統(tǒng)可連續(xù)在線實時恒壓監(jiān)測反硝化過程中N2O、NO、N2、O2和CO2的濃度變化，密封性較好，可準確定量N2。因此，本研究以中國農業(yè)大學在山東壽光的大棚蔬菜地的長期定位試驗點土壤為研究對象，采用原位土壤硅膠管測定法和自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng))研究剖面原位N2O濃度變化和各土層反硝化產(chǎn)物的產(chǎn)生特征，為準確定量地測定設施菜田土壤反硝化損失、N2O和NO的排放量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點概況

本試驗田是中國農業(yè)大學在山東省壽光市羅家村(36o55'N，118o45'E)的一個長期定位試驗點。該試驗點建于2004年，每年種植兩季番茄。所選溫室為該地區(qū)典型的傳統(tǒng)冬溫式日光溫室，采用后土墻(3.5 m)，水泥柱和竹架結構，種植土地寬7.8 m，長84 m，種植面積為655 m2，常年覆蓋乙烯–醋酸乙烯(EVA)多功能復合膜。當?shù)氐淖匀荒杲邓繛?58 mm，平均溫度12.4℃。試驗初始時，0—10 cm土層土壤有機質含量為18.3 g/kg，全氮1.37 g/kg，-N 112 mg/kg，速效鉀 299 mg/kg，速效磷299 mg/kg，容重1.44 g/cm3。有關試驗點的更多細節(jié)參考 Ren 等［19］。

1.2 試驗設計和方法

試驗分為田間原位測定和室內培養(yǎng)試驗兩個部分。

1.2.1 田間原位測定 試驗從2010年3月21日開始，到2010年5月28日結束，包括2010年冬春季的所有6次追肥時期。試驗處理包括:1)空白對照處理(CK)，不施用有機肥和化學氮肥;2)農民傳統(tǒng)施肥處理(CN)，即在實驗開始前，施風干雞糞8 t/hm2，相當于N 146 kg/hm2，均勻撒入作為基肥?；瘜W氮肥作為追肥和灌溉水一起施用。追肥時間根據(jù)作物的生長發(fā)育情況由農戶決定，每次用量為N 120 kg/hm2，共6次，共施 N 720 kg/hm2。6次追肥時間分別為3月26日、4月7日、4月22日、4月30日、5月10日和5月19日，每次灌溉量約為50 mm。小區(qū)面積為7.8 m ×5.6 m，3次重復。

采用硅膠管法對土壤剖面的N2O濃度進行觀測［20］。在每個小區(qū)的50 cm和90 cm處，埋下水平纏繞成圈形的硅膠管，硅膠管的一端封閉，另一端連接Teflon小管。Teflon小管內徑2 mm，外徑4 mm，另一端連接三通閥，三通閥露出地表10 cm。硅膠管壁厚3 mm，內徑10 mm，長1.3 m，內部集氣體積約100 mL。采氣時，用60 mL注射器連接三通閥，抽大約40 mL氣體。采氣后，打開三通閥使它與大氣相通，以便平衡里面氣壓，隨后關閉。在施肥前采氣一次，施肥后約每隔一天采氣一次。

1.2.2 室內培養(yǎng)試驗 在作物生長季，施肥灌水前(2010年5月9日)，在每個小區(qū)的0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm和80—100 cm處各取200 g土樣，過2 mm篩后，在4℃下儲藏備用。取土樣12 g放入120 mL培養(yǎng)瓶中，加去離子水25 mL，瓶中加有磁力攪拌器，每次攪拌時間為30 s，停頓10 s，以使氣液相平衡。用充氣抽真空清洗系統(tǒng)(帥恩科技，北京)抽真空后，用He氣充滿，反復沖洗3次。最后培養(yǎng)瓶中的He氣壓約為1.5個大氣壓，然后在瓶塞上插入一個沒有活塞的注射器，里面放有少量水，用來平衡瓶內氣壓。隨后放在恒溫18℃的水浴培養(yǎng)，由自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng)，挪威生命科學大學研發(fā))自動進樣［18］，測量里面N2O，O2，CO2，NO和 N2等氣體的變化。為了避免的不足，在培養(yǎng)至48 h時，每個培養(yǎng)瓶注入1 mL濃度為140 mmol/L的-N。為監(jiān)測碳源對反硝化過程的影響，培養(yǎng)至184 h時，注入1 mL濃度為87 mmol/L的-N和145 mmol/L的葡萄糖。整個培養(yǎng)時間為330 h，在此期間Robot系統(tǒng)每8 h持續(xù)地記錄 NO、N2O、O2和 N2濃度的變化情況。

1.3 樣品采集和測定

1.3.1 氣樣的采集和測定 田間試驗氣體采樣后，在24h內上氣相色譜測量N2O濃度。該氣譜采用裝有微池電子捕獲檢測器(HP 6890 Miceo-ECD)的美國產(chǎn)Agilent 6890氣相色譜儀，柱溫為55℃，檢測器溫度330℃。載氣為純度99.999%的高純氮氣，流速25 mL/min。

室內培養(yǎng)試驗的 N2O、O2、CO2、NO和 N2等氣體的變化由Robot自動培養(yǎng)系統(tǒng)測定。自動培養(yǎng)系統(tǒng)包括自動進樣模塊和氣體分析模塊。自動進樣模塊包括頂空自動采樣器(CTC GC-Pal)和雙向旋轉的蠕動泵(Gilson Minipuls 3)組成。氣體分析模塊由氣相色譜儀(Agilent GC 7890A，美國)和氮氧化物分析儀(TAPI Model 200E)組成，其中氣相色譜內安裝有3個檢測器(ECD、TCD、FID)和4根分離柱(填充柱和毛細柱各2根)，能夠分離和測定N2O(ECD)、N2(TCD)、O2(TCD)和 CO2(TCD)。

1.3.2 其他參數(shù)的測定 培養(yǎng)前后，用0.1 mol/L的KCl進行浸提，用連續(xù)流動分析儀(TRACCS2000，德國產(chǎn))測定各層土壤樣品中和的含量。采用碳、氮分析儀(vario MACRO CN)測定不同土層土壤中的有機碳和全氮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5分析軟件進行單因素方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 追肥后剖面原位N2O濃度的變化特征

圖1 追肥后設施菜田土壤剖面50 cm處N2O的變化Fig.1 The N2O dynamics at 50 cm soil depth in the greenhouse vegetable cropping system after the side-dressing

追肥后設施菜田剖面N2O濃度的變化特征見圖1和圖2。由圖1和2可見，每次灌溉追肥后，CN處理剖面原位50 cm處和90 cm處的N2O的濃度都會出現(xiàn)一個濃度峰值，且每次50 cm處的N2O濃度的峰值都高于90 cm處。CN處理剖面50 cm處的N2O 變化在 2.15 ～50.77 μL/L 之間，平均為 9.92 μL/L。相對于50 cm處，CN處理剖面90 cm處的N2O 濃度變化幅度較小，在 2.57 ～14.05 μL/L 之間，平均為5.64 μL/L。與CN處理相比，CK處理的剖面原位N2O濃度卻幾乎不受灌溉的影響，50 cm處和90 cm處的N2O濃度的變幅較小，在1.43～2.75 μL/L 之間。

圖2 追肥后設施菜田土壤剖面90 cm處N2O的變化Fig.2 The N2O dynamics at 90 cm soil depth in the greenhouse vegetable cropping system after the side-dressing

2.2 不同土層N2O產(chǎn)生的潛勢

從圖3可以看出，不同土層產(chǎn)生N2O的潛勢不同，在開始的48 h內，CK和CN處理0—20 cm土層產(chǎn)生的N2O的量均迅速增加，但CK處理產(chǎn)生的N2O排放峰值遠低于CN處理。CK處理產(chǎn)生的N2O峰值為N2O 20.6 nmol/g土，而CN處理產(chǎn)生N2O量的峰值則高達 315.0 nmol/g土(圖 3 a)。20—40 cm土層，從開始到添加葡萄糖前，CN處理的N2O產(chǎn)生量一直增加，但增加速度并沒有0—20 cm土層快，而CK處理N2O的產(chǎn)生量變化卻較小(圖3 b)。在開始的48 h內，40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm三個土層，CK和CN處理的N2O產(chǎn)生量都較小(圖3 c，d，e)，添加KNO3后，這三個土層的N2O的產(chǎn)生量并沒有較大改變。

在184 h注入硝酸鉀和葡萄糖后，CN處理的0—20 cm和20—40 cm土層土壤并沒有產(chǎn)生N2O，甚至開始消耗N2O(圖3 a，b)，這與在反硝化活性較強的土壤中，增加碳源將促進N2O還原有關［21］。而40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm的土壤兩個處理卻都開始產(chǎn)生N2O，并和CN處理20—40 cm土層土壤類似，在264 h左右出現(xiàn)一個小的排放峰值，與反硝化過程較強烈有關(圖4)。

2.3 不同土層的反硝化潛勢

從圖4可以看出，不同土層土壤的反硝化潛勢有很大差別。在培養(yǎng)開始的48 h內，CK和CN處理的0—20 cm土層土壤的反硝化產(chǎn)物不斷的增加，其中CN處理高于CK處理的(圖4 a)。其他各層CK和CN處理的反硝化產(chǎn)物均較少(圖4 b，c，d，e)。在加入充足的后，兩個處理的0—20 cm土層的反硝化產(chǎn)物仍然不斷增加，且遠高于其他各層。兩個處理在20—40 cm土層的反硝化產(chǎn)物也有不斷增加的趨勢，但增加趨勢相對0—20 cm土層較慢(圖4 a，b)。在添加的條件下，40—60 cm，60—80 cm，80—100 cm的反硝化產(chǎn)物的量卻幾乎沒有增加(圖4 c，d，e)，這說明土壤反硝化過程主要發(fā)生在0—20 cm和20—40 cm土層。184 h時，隨著碳源葡萄糖的加入，CK和CN兩個處理0—20 cm土層土壤的反硝化產(chǎn)物迅速地增加，其中CN處理增幅比CK大，產(chǎn)生的氮(N)從184 h的5045.4 nmol/g，增加到 264 h 的 28006.1 nmol/g，增加了近6倍。而其他各層的兩個處理，在添加碳源后反硝化產(chǎn)物卻沒有立即迅速增加，而是經(jīng)過約48 h的滯后期后，即在232 h時開始迅速的增加，直到達到穩(wěn)定的N2濃度平臺。

2.4不同土層土壤性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化

由表1結果看出，在0—20和20—40 cm土層土壤中，CN處理的有機碳和有機氮顯著高于CK處理，40—60 cm，60—80 cm 和80—100 cm 的土層土壤中，CN和CK處理之間沒有顯著性差異。此外，在相同處理條件下，上層(0—40 cm)土壤的機碳和有機氮含量顯著高于底層(60—100 cm)土壤。

2.5 不同土層NO產(chǎn)生的潛勢

反硝化過程中，土壤除了會產(chǎn)生N2O和N2等氣體外，還會產(chǎn)生NO。從圖5可以看出，在開始的16 h內，CK和CN處理0—20 cm土層產(chǎn)生NO的量都迅速增加，但CN處理產(chǎn)生的NO量遠高于CK處理。CN處理產(chǎn)生的NO峰值為每克土產(chǎn)生12.6 nmol的NO，而CK處理產(chǎn)生的峰值則為每克土4.2 nmol的NO(圖5 a)。在20—40 cm土層，從開始到添加葡萄糖前，CN處理的NO產(chǎn)生量一直增加，而CK處理的NO濃度卻變化較小(圖5 b)。從開始到添加KNO3，40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm 三個土層，CK和CN處理的NO的產(chǎn)生量均較小(圖5 c，d，e)。當加入碳源后，各土層都會出現(xiàn)一個短暫的NO的排放小峰，這與反硝化過程的強烈進行有關(圖4)。

3 討論

設施菜田土壤剖面N2O的濃度高出糧田的幾十倍［23］，這主要和設施菜田碳、氮和水的高投入有關。與傳統(tǒng)的施肥處理相比，不施肥的對照處理土壤剖面N2O濃度較低，且?guī)缀醪皇芄嗨挠绊懀f明碳、氮的投入為反硝化過程提供了底物，在此基礎上，灌水會增加嫌氣區(qū)域，促進反硝化過程的進行。但如果土壤中缺少底物碳和氮，即使在灌水厭氧條件下，反硝化過程進行的也相對較弱。

反硝化和N2O產(chǎn)生能力較強的均是上層(0—40 cm)土壤，而40—100 cm的底層土壤受碳源限制，反硝化較難進行，不太可能產(chǎn)生高濃度的N2O。田間檢測到的底層土壤的高濃度N2O可能是來源于表層土壤N2O的擴散，本研究結果中，50 cm處N2O濃度遠高于90 cm也支持了這一推測，說明通常的田間表層通量觀測會低估N2O的排放量。而這些高濃度的N2O，最終是長期滯留在土壤底層還是會被上層土壤再次還原成N2，還需要進一步的研究。

與范曉暉和朱兆良對三種農田土壤的研究結果類似，設施菜田反硝化也主要發(fā)生在表層，因為表層的土壤有機碳較高，為反硝化微生物提供了能源［24］。底層土壤的微生物可利用的有機碳較少，反硝化活性一般較弱。但加入碳源后，其反硝化潛勢在經(jīng)過一個滯后時期后迅速增加，并達到與表層土壤產(chǎn)生的反硝化潛勢相當?shù)某潭?。這說明當有足夠的碳源時，反硝化微生物活性會迅速增強。在田間條件下，有機碳和硝酸鹽的向下移動，可能會促進底層土壤反硝化的進行，但目前人們通常取表土來定量反硝化損失［25-26］。在大田條件下，由于有機肥施用量較低，灌水次數(shù)較少，下層土壤的反硝化損失或許可以忽略。然而在設施菜田中，化肥和有機肥的大量投入以及頻繁的灌水［27-28］，將為底層土壤提供一定的碳源和硝酸鹽，對反硝化有促進作用。不考慮這部分土壤的反硝化損失，有可能低估氮素氣態(tài)損失量。

綜上所述，在田間條件下，雖然設施菜田土壤反硝化過程主要發(fā)生在表層，但是施肥和灌溉后，N2O有向剖面下部遷移的趨勢，田間的通量觀測有可能低估N2O的產(chǎn)生量。同時，底層土壤也有一定的反硝化潛勢，在定量研究土壤氮素的反硝化損失時，應當予以考慮。

表1不同土層土壤的性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化Table 1 Soil characteristics，measured N －species at the start and end of the incubation in different soil layers

表1不同土層土壤的性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化Table 1 Soil characteristics，measured N －species at the start and end of the incubation in different soil layers

注(Note):*表示相同土層CK和CN處理之間的差異顯著(P＜0.05)Significant difference for CK and CN treatments in the same soil layers(P＜0.05);不同字母表示相同施肥處理不同土層差異顯著(P＜0.05)The different letters in the same treatment mean significant difference for different soil layers(P ＜0.05).

處理Treatment土層Layer(cm)有機碳Organic C(g/kg)有機氮Organic N(g/kg)培養(yǎng)前Start NH+4-N(mg/kg)培養(yǎng)前Start NO-3-N(mg/kg)培養(yǎng)后End NH+4-N(mg/kg)培養(yǎng)后End NO-3-N(mg/kg)CK 0—20 8.9 ±0.5 a 1.2 ±0.0 a 6.1 ±0.3 a 22.3 ±1.3 a 31.9±3.1 a 0.7 ±0.4 a 20—40 4.3 ±0.2 b 0.6 ±0.0 b 2.5 ±0.5 c 4.2 ±1.5 b 30.7 ±2.3 a 0.9 ±1.0 a 40—60 3.7 ±0.4 bc 0.6 ±0.0 b 5.8 ±0.3 a 6.0 ±3.0 b 27.0 ±0.7 a 1.0 ±0.8 a 60—80 2.9 ±0.2 cd 0.4 ±0.0 cd 5.3 ±1.2 ab 6.3 ±0.7 b 9.6 ±3.1 b 1.5 ±0.7 a 80—100 2.2 ±0.3 d 0.4 ±0.0 d 3.4 ±0.5 bc 5.2 ±1.5 b 12.0 ±2.5 b 0.9 ±0.6 a CN 0—20 12.2 ±0.3*a 1.7 ±0.1*a 5.7 ±0.9 a 107.0 ±15.5*a 44.0 ±2.8 a 1.0 ±0.7 a 20—40 6.3 ±1.1*b 0.9 ±0.1*bc 2.7 ±0.7 b 47.2 ±7.4*b 31.6 ±12.2 ab 0.9 ±0.7 a 40—60 4.9 ±0.5 bcd 0.7 ±0.1 cd 5.0 ±0.9 a 36.5 ±4.2*b 31.2 ±2.5 ab 0.8 ±0.7 a 60—80 3.5 ±0.3 cd 0.5 ±0.0 d 4.7 ±1.2 a 31.5 ±5.5*b 25.5 ±0.2*bc 0.7 ±0.2 a 80—100 2.9 ±1.1 d 0.5 ±0.1 d 4.1 ±0.3 a 36.3 ±3.8*b 13.3 ±3.5 c 0.4 ±0.6 a

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