楊 睿，喻 花，王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

1 引言

蛋白質(zhì)通常是藥物在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的主要靶點(diǎn)，在藥物作用機(jī)理的過(guò)程中，大多數(shù)藥物都是通過(guò)與生物大分子靶點(diǎn)相互作用來(lái)發(fā)揮藥效的。因此，深入研究蛋白質(zhì)與藥物小分子之間的相互作用的過(guò)程和機(jī)理，不僅有助于從分子水平上理解藥物的作用機(jī)制，也可為篩選以特定蛋白為靶點(diǎn)的藥物先導(dǎo)體以及新藥的開(kāi)發(fā)與設(shè)計(jì)開(kāi)辟新的途徑。

目前對(duì)藥物分子與生物靶分子的作用的研究主要有以下方法:紫外－可見(jiàn)分光光度法、熒光光譜法、圓二色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、核磁共振法、電化學(xué)方法等［1～5］。近年來(lái)，超濾質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為研究藥物分子與生物靶分子的作用提供了新的方法。超濾質(zhì)譜技術(shù)是一種將超濾技術(shù)與質(zhì)譜分析方法聯(lián)合使用所形成的一種新的研究手段，主要是利用親和原理，將生物靶分子與潛在藥物分子混合得到受體－配體復(fù)合物和未結(jié)合的藥物分子，通過(guò)超濾來(lái)將未結(jié)合的藥物分子去除，然后用有機(jī)溶劑或者改變?nèi)芤簆H值將復(fù)合物中的藥物分子釋放出來(lái)，用LC－MS檢測(cè)釋放出來(lái)的活性藥物分子進(jìn)行分析鑒定。該方法將超濾技術(shù)的分離特性與質(zhì)譜技術(shù)的高速，高靈敏性，高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，可以很方便的識(shí)別與生物靶分子相結(jié)合的藥物配體，從而實(shí)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的快速篩選［6，7］。

大豆異黃酮的基本骨架為3－苯基苯并二氫呋喃，主要有黃豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆苷［8］。天然存在的大豆異黃酮較多，共有12種，它們大多以β葡萄糖苷形式存在，其中起生理藥理作用的主要是染料木素和大豆黃素。大豆異黃酮因具有明顯的生物學(xué)活性，如抗腫瘤作用、對(duì)血管的防護(hù)作用、抗氧化活性、抗炎、改善骨質(zhì)疏松、類似女性雌激素作用以及抗激素作用等［9］，有關(guān)大豆異黃酮類藥物和保健品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用已經(jīng)被廣泛關(guān)注。

本工作采用超濾質(zhì)譜的方法，對(duì)人血清白蛋白與4種主要的大豆異黃酮及大豆異黃酮粉樣品的結(jié)合做了研究，證明了大豆異黃酮粉中的主要成分為大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，并且以此為模型確立了一套用超濾質(zhì)譜法篩選快速篩選蛋白質(zhì)配體的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司);Agilent 6520 Q－TOF四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);GL－20M高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);YM－10超濾膜購(gòu)自Millipore公司;大豆異黃酮片購(gòu)自吉林修正藥業(yè)保健品有限公司;人血清白蛋白HSA購(gòu)于Sigma公司;大豆苷、大豆苷原、染料木素、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95%，購(gòu)自Sigma公司;甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)MERCK公司);水為超純水(Molelement 1815a摩爾元素型超純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司);其他試劑均為優(yōu)級(jí)純。

2.2 樣品制備

樣品制備方法參考已知文獻(xiàn)［13，14］，大豆異黃酮片粉碎60℃真空干燥至恒重，過(guò)100目篩板，密封備用。準(zhǔn)確稱取5.0 g大豆異黃酮片粉末，按照料液比1∶5加入70%甲醇，浸泡120 min后超聲提取60min，提取液4000 r/min離心15min后取上清備用。大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配成4 mol·L－1的儲(chǔ)備液。人血清白蛋白用10 mM的CH3COONH4溶液(pH 值=6.86)配成40μM備用。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱為 C18分析柱(150 mm×4.6 mm×5μm)，柱溫 25 ℃，流速 0.4 mL·min－1。液相條件:流動(dòng)相A為純水，B為乙腈，梯度洗脫。t=0 min，80%A(20%B);t=0 ～5 min，70%A(30%B);t=5～15 min，40%A(60%B);t=15 ～20 min，5%A(95%B)。進(jìn)樣體積為5μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離離子源(ESI);負(fù)離子模式檢測(cè);掃描范圍m/z 100～1000;毛細(xì)管溫度350℃;噴霧電壓4.0 kV;干燥氣流速 10 L·min－1;碎裂電壓 175V。

2.4 超濾實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法［10～12］，吸取 10μL 大豆異黃酮粉提取物溶液和人血清白蛋白溶液10μL加至10 mM的醋酸銨緩沖溶液中，室溫反應(yīng)30 min，置于YM－10型超濾管中于離心力10000r/min下超速離心15 min，濾膜加10 mM醋酸銨緩沖液離心清洗3次，將未結(jié)合配體分子洗去。再向?yàn)V膜中加入甲醇/水(50∶50;V/V)，靜置30 min后于10000 r/min下離心15 min，重復(fù)3次，收集洗脫液用于LC－MS分析。為排除超濾膜自身對(duì)于小分子的吸附作用引起的實(shí)驗(yàn)誤差，在每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)加入一組不加蛋白質(zhì)的空白實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的液質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)分析

將大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品配置成總濃度為40 μM的混合溶液，其中各組分的最終濃度均為10 μM。優(yōu)化LC分離條件和ESI－MS的儀器條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行分離和ESIMS檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混樣超濾質(zhì)譜提取離子流圖(EIC)

由圖1可以看到混合溶液在C－18柱中分離出了4個(gè)色譜峰，4個(gè)組達(dá)到了基線分離并且峰型比較對(duì)稱無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。用Q－TOF質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件將4種大豆異黃酮物質(zhì)在負(fù)離子模式下可能形成的離子進(jìn)行分析計(jì)算，見(jiàn)表1。

表1 4種大豆異黃酮物質(zhì)在負(fù)離子模式下可能出現(xiàn)的帶電離子類型及精確分子量

圖2中，(a)(b)(c)(d)分別為保留時(shí)間1.713min、3.805min、6.848min 和 9.953min 的質(zhì)譜圖。對(duì)比表1可知，圖2(a)中保留時(shí)間為1.713min的物質(zhì)是大豆苷，質(zhì)譜圖中的主要離子為 m/z 253.05023、415.10324、451.08016、461.10906 和 475.12502，分別為大豆苷元的(M－H)－，(大豆苷具有一定的不穩(wěn)定性，在本實(shí)驗(yàn)條件下有可能在離子源中或質(zhì)譜中分解為大豆苷元)，大豆苷的(M－H)－，大豆苷的(M+Cl)－，大豆苷的(M+HCOO)－及大豆苷的(M+CH3COO)－峰。(b)中保留時(shí)間為3.805 min的物質(zhì)是染料木苷，質(zhì)譜圖中m/z 431.09998的離子為染料木苷的(MH)－峰。(c)中保留時(shí)間為6.848min的物質(zhì)是大豆苷元，m/z 253.05174離子為大豆苷元的(M －H)－峰。(d)中m/z為269.04654為染料木苷的(M －H)－峰，確定9.953min的物質(zhì)為染料木素。

圖2 4種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)物混合溶液中各組分的質(zhì)譜圖

圖3 pH值6.86時(shí)大豆異黃酮粉樣品與HSA的超濾質(zhì)譜EIC圖

3.2 超濾質(zhì)譜法篩選大豆異黃酮粉中與人血清白蛋白結(jié)合的黃酮類成分

大豆異黃酮粉實(shí)際樣品與HSA孵育后，進(jìn)行超濾實(shí)驗(yàn)，所得溶液進(jìn)行LC－MS分析，HPLC分離條件和質(zhì)譜條件與上述標(biāo)準(zhǔn)品一致。對(duì)所得到的總離子流圖提取4種大豆異黃酮所可能的電荷分子做EIC提取離子流圖，結(jié)果如圖3所示。與空白對(duì)照組(即未加蛋白質(zhì)組)相比，加入HSA蛋白質(zhì)的樣品組中4組EIC峰都存在不同程度的增加。因?yàn)樵谙嗤瑢?shí)驗(yàn)條件下，色譜峰的積分面積與溶液中物質(zhì)的濃度成正比，通過(guò)對(duì)比兩組不同實(shí)驗(yàn)色譜峰的積分面積可以知道4種大豆異黃酮與HSA都有著不同程度的結(jié)合。圖4中(a)(b)(c)(d)分別為4組峰的MS譜圖。與4種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)物的EIC和MS進(jìn)行比較，通過(guò)4組峰的保留時(shí)間和每組峰質(zhì)譜的特征離子，可以確認(rèn)4個(gè)峰所代表的物質(zhì)按照保留時(shí)間先后順序分別為大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素。

圖4 大豆異黃酮粉樣品中四種物質(zhì)的ESI－MS譜圖

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用超濾質(zhì)譜法研究大豆異黃酮粉及人血清白蛋白，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖以及提取離子流圖確定復(fù)雜樣品中與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的有效物質(zhì)，建立起了一套行之有效的快速篩選天然產(chǎn)物中有效成分的方法。此方法也可以擴(kuò)展應(yīng)用于其他天然藥物提取物中活性成分的快速確認(rèn)和鑒定。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)該注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題:超濾膜的選擇，目前市面上可供選擇的超濾膜有很多種，需要根據(jù)對(duì)象蛋白質(zhì)的分子量來(lái)選取合適型號(hào)的超濾膜，同時(shí)還要考慮超濾膜的死體積大小;孵育過(guò)程中需要控制蛋白質(zhì)與配體的相對(duì)摩爾比，以達(dá)到較好的吸附效果;超濾試驗(yàn)中解離液的選擇，常用的解離液包括有機(jī)溶劑解離液和酸性或者堿性解離液。在本實(shí)驗(yàn)中，由于黃酮苷樣品在酸性條件下會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，所以選用的有機(jī)溶劑作為解離液。

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