黃樹(shù)其 牛富生 邵福源

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200003)

血管性癡呆(VaD)是老年期癡呆的重要病因。有研究表明癡呆的發(fā)生過(guò)程中除腦結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變外，腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)及酶類〔如乙酰膽堿(Ach)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)等〕的代謝也發(fā)生異?！?〕。ChAT被認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)ACh的促進(jìn)代謝生成酶，在記憶相關(guān)腦區(qū)的含量高低與學(xué)習(xí)記憶能力呈正相關(guān)〔1〕。

近年國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在缺血缺氧狀態(tài)下促紅細(xì)胞生成素(EPO)分泌增多，并被證實(shí)是腦組織對(duì)缺血缺氧的保護(hù)性機(jī)制;EPO還可以改善VaD大鼠以及腦缺血后認(rèn)知功能障礙〔2〕，但是具體機(jī)制并不清楚，推測(cè)ChAT可能在EPO改善VaD大鼠認(rèn)知功能障礙過(guò)程中起到一定作用。因此，本研究觀察VaD大鼠海馬CA1區(qū)ChAT蛋白含量以及ChAT mRNA表達(dá)水平的變化，以確定ChAT在EPO改善VaD大鼠認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 月齡超過(guò)16個(gè)月的Wistar大鼠，體重(296±35)g，雌雄不限(購(gòu)自上海市BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，用Y型迷宮訓(xùn)練篩選符合標(biāo)準(zhǔn)〔3〕大鼠86只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 重組人EPO(rhEPO，沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司)，一抗(ChAT兔抗大鼠血清)、即用型SABC試劑盒、RT-PCR試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司，總RNA抽提試劑盒(華舜生物工程公司)，引物由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。MG-3型Y-迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)，立體定位儀(美國(guó)ASI公司)，MP120電子天平(上海第二天平儀器廠)，YL-3型石蠟切片機(jī)(上海儀表廠)，CH型光學(xué)顯微鏡、BX60顯微照相機(jī)(日本Olympus公司)，PCR儀(美國(guó)Beckerman公司)，DY-A型電泳儀、Flous-S multiImage圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，紫外透射分析儀(上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 VaD模型制作

1.2.1.1 側(cè)腦室套管埋植術(shù) 參照Paxinos及Wistar鼠腦圖譜〔4〕，借助PF5-48立體定位儀，用微型電動(dòng)顱鉆鉆孔，將外徑為0.5 mm的不銹鋼導(dǎo)引管插入左側(cè)腦室(AP 1.0 mm，L 1.5 mm，H 3.0 mm)，用502黏合劑和牙托粉固定于顱骨上，在引導(dǎo)管內(nèi)插入外徑為0.3 mm的不銹鋼內(nèi)管，其尖端比引導(dǎo)管長(zhǎng)1 mm，另一端和微量注射器相連。術(shù)后連續(xù)肌注抗生素1 w以抗感染。

1.2.1.2 VaD模型的建立 參照Olsson等〔5〕方法，以水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉后行頸正中切口，仔細(xì)分離肌肉，鈍性分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其下置7號(hào)手術(shù)線，注意避免刺激迷走神經(jīng)，小心結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口。VaD模型的驗(yàn)證方法參照文獻(xiàn)〔2〕。

1.2.2 分組 將86只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組。假手術(shù)組(Sham組):健康大鼠18只，經(jīng)手術(shù)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，埋線后不結(jié)扎而將手術(shù)線抽出，然后縫合傷口。除假手術(shù)組外均按1.2.1.2方法成功造模。VaD組:21只，EPO側(cè)腦室注射+VaD組(E1組):26只，側(cè)腦室套管埋植術(shù)成功1 w后造模，從側(cè)腦室注射 rhEPO，劑量為200 IU/kg，3次/w。EPO腹部皮下注射+VaD組(E2組):21只，造模后腹部皮下注射 rhEPO 1 250 IU/kg，3次/w。實(shí)驗(yàn)中保持溫度恒定。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)ChAT的表達(dá) 分別在術(shù)后4、8、12 w各隨機(jī)取3只大鼠，10%烏拉坦(1 g/kg)麻醉后打開(kāi)胸腔，將右心房剪開(kāi)，行左心室插管，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注37℃生理鹽水約500 ml，然后快速灌注4%多聚甲醛溶液(pH7.4)約250 ml，其間大鼠出現(xiàn)全身抽搐時(shí)將大鼠首尾拉直，之后減慢灌流速度，在1 h內(nèi)再灌注約250 ml 4%多聚甲醛灌注液，此時(shí)大鼠全身僵硬。灌注完畢后立即取出腦組織置于充滿灌注液的小瓶中，行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊作連續(xù)切片，厚度為4μm，并置于60℃烤箱中烘干后備用。取充分顯示海馬區(qū)的切片行免疫組織化學(xué)染色。將切片脫蠟至水化;然后經(jīng)100%二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液浸泡各5 min，蒸餾水沖洗;無(wú)水乙醇1 min，95%酒精1 min，85%酒精1 min，75%酒精1 min，蒸餾水沖洗2 min;將樣本置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗3×3 min，每片樣本滴加封閉液(過(guò)氧化物酶阻斷液)50μl，并在室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，吸去封閉液，PBS洗3×3 min。加50μl正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min;除去血清，加入抗體稀釋液配制的最佳稀釋度的第一抗體工作液(1∶100兔抗大鼠ChAT抗體)，于濕盒中4℃ 過(guò)夜;次日用PBS洗3×3 min，每片加抗體稀釋液配制的生物素標(biāo)記的第二抗體工作液，于室溫濕盒溫育1 h;用PBS洗3×3 min，每片加鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液50μl，于室溫下孵育10 min;用PBS洗3×3 min。每片加100μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，顯微鏡下控制顯色，顯色完成后用0.1 mol/L PBS(pH7.4)終止反應(yīng);切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。定量分析計(jì)數(shù)方法:每張切片在海馬的錐體細(xì)胞層，分別選擇6個(gè)相鄰視野，在15×10倍光鏡下做免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格，以“/0.9 mm2”為單位，結(jié)果取平均值。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)ChAT mRNA的表達(dá) 分別在4、8、12 w各組隨機(jī)取3只大鼠，20%烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉后用斷頭法處死，在冰浴中快速分離出雙側(cè)海馬CA1區(qū)，置于凍存管中液氮保存;然后按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行海馬組織總RNA提取、定量;分別取各組海馬組織總RNA抽提液1.0μg加至eppendorf管，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次加入 dNTP(10 mmol/L)5 μl，MgCl2(25 mmol/L)10 μl，10 ×buffer 5 μl，RNase Inhibitor(40 U/μl)1 μl，AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl，AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl，ChAT 上、下游引物各1 μl，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上、下游引物各 1 μl，加滅菌去離子水至50μl。以β-actin引物作為內(nèi)對(duì)照，配制內(nèi)對(duì)照反應(yīng)體系，以雙蒸水代替模板RNA作為陰性對(duì)照?；靹蚝蠹邮炗?0μl，再將各反應(yīng)管同時(shí)置于同一PCR擴(kuò)增儀中，PCR條件為:50℃，30 min;滅活逆轉(zhuǎn)錄酶并初步激活PCR反應(yīng):94℃，2 min;94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 28 個(gè)循環(huán)，最后反應(yīng)終止于72℃ 10 min。β-actin上游引物為5'CCTCTATGCCAACACAGTGC 3'，下游引物為5'GTACTCCTGCTTGCTGATCC 3'，產(chǎn)物大小為211 bp。ChAT上游引物為5'CAGAAGAGCAGTATCATGCCCGA3'，下游引物為 5'TCCAGGCATACCAGGCAGATGCAG 3'，產(chǎn)物大小為296 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果用Flous-SmutiImager生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，記錄每條譜帶的面積灰度值，以每例組織電泳帶面積灰度值/β-actin電泳帶面積灰度值的比值作為該標(biāo)本目的基因表達(dá)的相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，測(cè)定值以x±s表示，采用方差分析進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，兩組間采用直線相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ChAT免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕褐色沉淀物。Sham組海馬錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元最密集。術(shù)后4 w，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元減少，與Sham組相比均顯著降低(P＜0.01)，VaD組與E1組或E2組之間均存在顯著性差異(P＜0.05);術(shù)后8 w和12 w時(shí)，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)一步減少，VaD組比同期E1組或E2組的減少更為顯著(P＜0.01)，但E1組與E2組海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。術(shù)后4 w、8 w和12 w，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬 CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)與相應(yīng)時(shí)間的全天總反應(yīng)時(shí)間(TRT值)呈顯著負(fù)相關(guān):r=－0.869(P＜0.05)，與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力呈正相關(guān)。由此可知，EPO上調(diào)VaD大鼠海馬CA1區(qū)ChAT蛋白表達(dá)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 ChAT mRNA表達(dá)結(jié)果 Sham組大鼠術(shù)后4 w、8 w和12 w海馬CA1區(qū)ChAT mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異;與Sham組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著減少(P＜0.05或P＜0.01);但E1組與E2組大鼠ChAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元比較(x ± s，n=3)

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元(×400)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)ChAT mRNA的表達(dá)(x±s)

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)ChAT mRNA RT-PCR電泳圖

3 討論

ChAT為膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿合成的限速酶，分子量為60～70萬(wàn)，活性中心有咪唑基和巰基，與乙酰輔酶A結(jié)合使咪唑基乙?；?然后，膽堿與ChAT活性中心的陰離子部位結(jié)合，將乙?；D(zhuǎn)移到膽堿上，合成Ach。ChAT在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志，其活性變化能直接影響神經(jīng)元內(nèi)Ach的合成，從而影響正常神經(jīng)元的功能，可以作為膽堿能神經(jīng)元功能狀態(tài)的明確標(biāo)志。由于ChAT可合成Ach，而Ach具有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的生物功能，因此認(rèn)為ChAT在腦內(nèi)的含量高低與動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能呈正相關(guān)。而ChAT含量和活性高低與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的直接證據(jù)則來(lái)源于發(fā)現(xiàn)在AD病人大腦皮質(zhì)和海馬中，ChAT和AchE的活性明顯下降，與正常同年齡對(duì)照組的腦組織相比ChAT大約減少50%～90%。這一發(fā)現(xiàn)隨后又為許多實(shí)驗(yàn)室所證實(shí)，但因這些數(shù)據(jù)均來(lái)自尸檢而受到質(zhì)疑。后來(lái)在AD患者大腦活檢標(biāo)本中也觀察到Ach合成能力和ChAT活性均降低，并且通過(guò)ChAT單克隆抗體免疫組化發(fā)現(xiàn)AD病人受損的內(nèi)側(cè)前腦Meynert核細(xì)胞含有ChAT的細(xì)胞。因此，目前公認(rèn)基底前腦ChAT活性下降是AD的一個(gè)重要的生化改變。有研究發(fā)現(xiàn)，AD病人的認(rèn)知功能衰退與腦神經(jīng)ChAT活性及ChAT陽(yáng)性纖維數(shù)量與老年斑增多具有相關(guān)性〔6〕，AD病人ChAT活性明顯低于正常對(duì)照組，并且與病人死前簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)得分存在相關(guān)性〔7〕。這些研究證明了ChAT含量與癡呆病人的認(rèn)知功能衰退存在直接的因果關(guān)系，因而本實(shí)驗(yàn)選取ChAT作為的研究對(duì)象。

1997年美國(guó)慢性腎臟病診療(DOQI)指南規(guī)定rhEPO的用量:皮下注射為每周80～120 IU/kg，靜脈給藥為每周 120～180 IU/kg;1999年歐洲指南規(guī)定為每周50～150 IU/kg。而目前文獻(xiàn)報(bào)道 rhEPO劑量從 375 IU/kg，2次/w～700 IU/kg，3次/w不等。多數(shù)作者研究表明，rhEPO劑量＜300 IU·kg－1·w－1難以奏效，故目前多數(shù)學(xué)者建議最適劑量為500～750 IU·kg－1·w－1。根據(jù)熊遠(yuǎn)珍〔8〕計(jì)算的人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體表面積折算的單位重量用藥量換算系數(shù)，大鼠腹部皮下注射rhEPO用量應(yīng)為1 250 IU/次，故本研究選擇側(cè)腦室200 IU·kg－1·次－1和腹部皮下1 250 IU·kg－1·次－1，3次/w注射。本次研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室和腹部皮下注射兩種給藥方式并無(wú)顯著性差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，VaD大鼠海馬CA1區(qū)ChAT蛋白及mRNA表達(dá)均下降，且下降程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，與文獻(xiàn)報(bào)道相符〔9〕。VaD大鼠海馬CA1區(qū)ChAT缺乏導(dǎo)致Ach的合成減少，可能是導(dǎo)致大鼠空間辨別及學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因。ChAT表達(dá)下降的原因可能與腦血流減少引起合成原料(乙酰CoA和分子氧)的供給不足有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，EPO組(E1組和E2組)大鼠海馬CA1區(qū)ChAT蛋白和ChAT mRNA表達(dá)較Sham組明顯下降，但在4 w、8 w和12 w時(shí)與同期VaD組比較顯著增加，提示EPO能使VaD大鼠海馬CA1區(qū)ChAT含量增加，這可能是EPO改善VaD大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一。EPO改善VaD大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制還有可能與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞、海馬CA1區(qū)神經(jīng)突觸的可塑性及抑制興奮性氨基酸的毒性作用等有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

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