李國棟 馬 宏 童坦君 張宗玉

(北京大學基礎醫(yī)學院生化系，北京 100191)

環(huán)境和遺傳是影響細胞和個體衰老進程的兩大因素，尤其是遺傳因素在衰老中發(fā)揮的作用正日漸得到學者們的重視。與腫瘤類似，衰老的啟動與進展不是由單一基因操縱的，而是受到一系列基因的協(xié)同調節(jié)。早期研究發(fā)現(xiàn)衰老過程伴有一些基因表達的上調及另一些基因表達的下調，這些基因的變化可作為該組織或細胞衰老的特異性生物學標志。因此，尋找參與細胞或個體衰老過程的基因和基因調控網(wǎng)絡是衰老基礎研究的重要內(nèi)容之一?；蛐酒夹g以核算雜交理論為基礎，利用固定在芯片上的幾千至幾萬條探針與樣品的mRNA進行雜交，在一次實驗中獲取大量信息?；蛐酒夹g使用了光控固相化學、激光共聚焦等多項先進技術，實現(xiàn)了全部自動化，操作快速、簡便。芯片技術的應用使得高通量分析細胞衰老等復雜基因調控網(wǎng)絡成為可能。盡管近年利用芯片技術對組織以及細胞衰老的研究逐漸增多，但是針對人胚肺成纖維細胞(2BS)復制性衰老的基因篩查仍未見報道。在此，我們用含有4 096種人類基因的基因芯片，檢測了2BS細胞在復制性衰老過程中的基因表達變化情況，結果顯示衰老細胞與年輕細胞相比有117種基因表達的變化幅度在2倍以上，變化幅度在2.5倍以上的基因有46種，而且我們挑選的9種差異表達基因經(jīng)RTPCR驗證與芯片結果基本一致。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 2BS細胞為衰老研究中心常規(guī)保存，細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞長至90%融合時，以1∶2分瓶傳代。一般定義為:細胞代齡(PD)在PD30及以下的為年輕細胞，PD55及以上的為老年細胞。

1.2 基因芯片雜交 使用RNeasy mini kit(QIAGEN，Germany)試劑盒提取不同代齡2BS細胞的總RNA，細胞的收集和處理參照動物細胞的操作步驟。分光光度法對RNA定量并通過凝膠電泳對RNA完整性進行評價。mRNA的提取使用Oligotex mRNA Midi kit(QIAGEN，Germany)試劑盒。cDNA探針的制備和純化參照許沈華等〔1〕方法進行，Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分別用于標記年輕2BS細胞(PD28)和衰老2BS細胞(PD64)的cDNA。標記探針95℃變性5 min后，與含有4 096條人類全長基因的 HGEC-40S cDNA芯片 (Biostar Genechip，China)在60℃雜交15～17 h。雜交后的芯片用2×SSC+0.2%SDS、0.1×SSC+0.2%SDS、0.1%SSC 洗滌 3次，每次 10 min，室溫晾干。檢測結果使用GenePix 4000B掃描，數(shù)據(jù)分析使用Gene-Pix 3.0軟件。通過預先選定40個管家基因作為內(nèi)參基因對Cy3和Cy5的原始信號進行均衡和修正。同時為了監(jiān)控芯片制備和雜交過程，設定水稻U2RNA、HCV外殼蛋白及空白液為陰性對照。

1.3 RT-PCR 從芯片結果中挑選9個在年輕和衰老2BS細胞中差異表達的基因進行RT-PCR驗證，β-actin作為對照基因(各基因的引物序列和產(chǎn)物大小見表1)。PCR反應體系一般為20μl，包括 cDNA 模板3～5 μl，25 mmol/L MgCl21.6 μl，10 mmol/L dNTP 0.4μl，上下游引物的最終反應濃度為0.4μmol/L，1 U的Taq DNA聚合酶。首先95℃變性1 min，每次循環(huán)包括95℃變性20 s，56～60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后，用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析。

2 結果

2.1 年輕與衰老2BS細胞基因表達譜的差異分析 芯片檢測結果中Cy5與Cy3信號強度的比值(Cy5∶Cy3)反映了年輕與衰老2BS細胞差異表達基因的相對水平，其中Cy5:Cy3大于2.0的基因定義為在衰老細胞中高表達的基因，而Cy5∶Cy3小于0.5的基因為在衰老細胞中低表達的基因。在檢測的4 096條人類基因中，有117條基因的Cy5∶Cy3大于2.0或小于0.5，變化幅度在2.5倍以上的基因有46種，提示這些基因的表達很可能隨著2BS細胞的衰老發(fā)生了變化，其中部分基因列于表2。基因功能歸類分析顯示，細胞衰老過程中下調的基因主要是細胞分裂或細胞周期相關基因，上調的基因則主要參與了細胞應激反應和蛋白分泌等生理過程，這與Ly等〔2〕報道的老年人皮膚成纖維細胞基因表達的變化相似。此外，差異表達的基因還涉及細胞骨架與細胞外基質重塑、物質代謝與蛋白修飾以及G蛋白偶聯(lián)受體與離子通道等介導的信號轉導過程(表2)。

表1 PCR擴增基因的引物序列及產(chǎn)物長度

表2 年輕2BS細胞與衰老2BS細胞基因表達譜的差異

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 RT-PCR驗證部分基因在2BS細胞衰老過程中的變化我們挑選了9個在芯片檢測中發(fā)生表達改變的基因(表1)，它們在復制性衰老過程中的表達變化情況目前尚未見報道。分別提取 PD27、PD35、PD42、PD48、PD54、PD60、PD64 的 2BS 細胞總RNA并逆轉錄合成cDNA，用于對這些基因的RT-PCR驗證和分析。在所檢測的9個基因中，除Diubiquitin無明顯變化外，其余8個基因的表達變化趨勢與芯片檢測結果一致，表達上調的基因有 Laminin α4、G0S8、GRK4、VCAM1 和 Selenoprotein P，下調的有Preproenkephalin、Mad2和TPKC1(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測部分差異表達基因在不同代齡2BS細胞的表達

3 討論

體外培養(yǎng)細胞的復制性衰老作為一種個體衰老的簡化模型，其可靠性已得到廣泛的認可，然而基因調控網(wǎng)絡的復雜性一定程度上阻礙了衰老分子生物學研究的進展。基因芯片技術是揭示衰老分子機制的一個重要手段，1999年Lee等〔3〕首次將基因芯片技術應用于衰老體系，發(fā)現(xiàn)限制熱卡攝入可使老年鼠的基因表達譜向青年型轉化。Lerner領導的科研小組應用基因芯片技術研究了老年人及Huchinson-giford早老癥皮膚成纖維細胞基因表達情況，并將衰老推斷為細胞分裂檢控點失控的一種疾病〔2〕。在此，我們以含有4 096條人類基因的cDNA芯片檢測了2BS細胞復制性衰老過程中的基因表達變化。cDNA芯片雜交結果顯示:2BS細胞的復制性衰老并不引起基因表達的廣泛變化，在所檢測的4 096條人類基因中，熒光強度值變化在2倍以上的基因僅有117條。表達下調的基因主要參與細胞周期的進程，如在促有絲分裂因子MPF核轉移過程中起作用的PLK和控制G2/M轉換的Cyclin B。表達上調的基因則主要包括參與細胞應激反應和蛋白分泌等生理過程的分子，如凝血酶原活化因子(t-PA)、補體C3以及參與蛋白分泌途徑的TRAMP分子。在差異表達基因中，有些基因已被證實在復制性衰老的成纖維細胞中高表達，如參與胎兒肺成熟的角質細胞生長因子(KGF)〔4〕隨年齡增加在肺成纖維細胞中的表達明顯升高，顯示可能與成人傷口愈合情況比胎兒差有關〔5〕。

我們挑選并利用RT-PCR進一步檢測了9個基因，它們在復制性衰老過程中的表達變化情況目前尚無報道，以下針對部分可能與衰老調節(jié)有關的基因進行討論。Preproenkephalin是衰老細胞中下調幅度最大的基因，其在年輕2BS細胞中表達很強，從PD39左右表達開始下調，PD51以后表達極弱，但在過氧化氫誘導的早老細胞中未檢測到前腦啡肽原基因表達的變化。研究顯示胞核內(nèi)腦啡肽水平的下降會導致抑郁行為，而前腦啡肽原敲除小鼠則不會出現(xiàn)抑郁表型〔6〕。鑒于Mianserin等抗抑郁藥可能通過模擬節(jié)食的作用延長線蟲的壽命〔7〕，因此前腦啡肽原及腦啡肽在細胞衰老中的作用值得進一步研究。衰老細胞下調幅度較大的基因中大部分與細胞有絲分裂進程相關，MAD2是細胞進入有絲分裂后期的檢控點蛋白。cDNA芯片和RT-PCR檢測結果均顯示MAD2在2BS細胞復制性衰老過程中表達下調，而且我們在過氧化氫誘導的早老細胞中同樣檢測到MAD2 基因表達的下調〔8〕。

鉀離子流動是膜電位改變的主要因素，有關神經(jīng)突觸和紅細胞等衰老過程中伴有膜電位降低或鉀離子流動性的改變已見諸文獻〔9，10〕，但與成纖維細胞衰老的關系目前還未見報道。我們發(fā)現(xiàn)復制性衰老的2BS細胞中一種外向整流的鉀離子通道TPKC1表達下調，而一種內(nèi)向整流的TWIK-1的表達上調;RT-PCR也驗證了TPKC1在2BS細胞衰老中的下調趨勢。我們推測TPKC1表達的下調可能是衰老細胞膜電位降低的原因之一。G0S8又稱G蛋白信號調節(jié)因子2(RGS2)，是唯一選擇性抑制Gqα的調節(jié)因子。2BS細胞衰老時G蛋白信號通路的負調控因子RGS2、RGS5及G蛋白耦聯(lián)受體激酶GRK4表達上調。由于RGS2和GRK4的表達上調均發(fā)生在2BS細胞的青年或中年時期(圖1)，因此推測他們的表達變化可能是成纖維細胞復制性衰老的早期事件之一。此外，RGS2基因缺失的老年小鼠表現(xiàn)為體重較輕而且脂肪沉積減少〔11〕，提示可能參與調控生理代謝過程而影響衰老。硒蛋白是指含有硒半胱氨酸的一類蛋白質，人血漿中50%的硒元素是以硒蛋白P(Selenoprotein P)的形式存在的。近年研究表明:硒蛋白P可與過氧化亞硝酸及磷脂氫過氧化物反應，參與細胞外抗氧化防御機制〔12〕。芯片結果和RT-PCR檢測均顯示衰老2BS細胞中硒蛋白P表達上調，這與衰老細胞中DNA鏈斷裂增加的現(xiàn)象似乎有些矛盾。Caldini等〔13〕曾報道:隨體外培養(yǎng)的MRC5成纖維細胞倍增次數(shù)的增加，細胞內(nèi)另外一種含硒的、參與清除自由基的蛋白質-谷胱甘肽過氧化物酶活性增強。因此我們推測衰老2BS細胞中硒蛋白P基因表達的上調是細胞復制性衰老過程中細胞內(nèi)外環(huán)境活性氧基團濃度升高導致的誘導性調節(jié)。Miles等〔14〕發(fā)現(xiàn)人體血漿中血管細胞黏附分子1(VCAM1)的濃度與年齡有良好的正線形關系，這與我們的檢測結果具有相同的變化趨勢;然而Shelton等〔15〕觀察到VCAM1在人臍帶血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)傳代過程中顯著下調。研究表明:轉入端粒酶催化亞單位基因可使內(nèi)皮細胞與成纖維細胞永生化，而且這兩種細胞復制性衰老時均表現(xiàn)端粒縮短、衰老相關β-半乳糖苷酶染色增加及特定的細胞周期分布，這說明體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞與成纖維細胞經(jīng)歷相似的衰老啟動事件，VCAM1表達差異與細胞的特異性有關;而且它的表達變化不是啟動復制性衰老的早期事件，而是細胞衰老的效應分子。

綜上所述，2BS細胞復制性衰老基因表達變化的主要特征是細胞周期進程相關基因的下調和細胞應激反應及分泌蛋白類基因的上調?；虮磉_譜的分析是細胞衰老和個體衰老研究中的一個重要手段，然而由于通過芯片等高通量分析技術獲得的基因信息往往數(shù)量巨大，難以建立簡單易測的分子生物學衰老指征。如果在對基因信息進行生物學分析的基礎上，針對部分感興趣的基因或聯(lián)合其他細胞學指征進行統(tǒng)計學分析將有助于細胞衰老的定性和定量評價，也有助于對細胞衰老基因調控網(wǎng)絡的研究。

1 許沈華，牟瀚舟，呂桂泉，等.高低轉移人卵巢癌細胞系基因表達譜差異〔J〕.中國腫瘤，2001;10(1):41-3.

2 Ly DH，Lockhart DJ，Lerner RA，et al.Mitotic misregulation and human aging〔J〕.Science，2000;287:2486-92.

3 Lee CK，Klopp RG，Weindruch R，et al.Gene expression profile of aging and its retardation by caloric restriction〔J〕.Science，1999;85:1390-3.

4 Shannon JM，Pan T，Nielsen LD，et al.Lung fibroblasts improve differentiation of rat type Ⅱ cells in primary culture〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2001;24(3):235-44.

5 Maas-Szabowski N，Shimotoyodome A，F(xiàn)usenig NE.Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism〔J〕.J Cell Sci，1999;112(12):1843-53.

6 Andras B，Kerstin M，F(xiàn)lorence N，et al.Preproenkephalin knockout mice show no depression-related phenotype〔J〕.Neuropsychopharmacology，2007;32:2330-7.

7 Petrascheck M，Ye X，Buck LB.An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature，2007;450(7169):553-6.

8 馬 宏，張 宗，童坦君.H2O2誘發(fā)人成纖維細胞衰老樣變化的基因表達譜〔J〕.生物化學與生物物理進展，2003;30(1):72-7.

9 Ross ST，Soltesz I.Selective depolarization of interneurons in the early posttraumatic dentate gyrus:involvement of the Na(+)/K(+)-ATPase〔J〕.JNeurophysiol，2000;83(5):2916-30.

10 Reiff DF，Guenther E.Developmental changes in voltage-activated potassium currents of rat retinal ganglion cells〔J〕.Neuroscience，1999;92(3):1103-17.

11 Nunn C，Zhao P，Zou MX，et al.Resistance to age-related，normal body weight gain in RGS2 deficient mice〔J〕.Cell Signal，2011;23(8):1375-86.

12 Mostert V.Selenoprotein P:properties，functions，and regulation〔J〕.Arch Biochem Biophys，2000;376(2):433-8.

13 Caldini R，Chevanne M，Mocali A，et al.Premature induction of aging in sublethally H2O2-treated young MRC5 fibroblasts correlates with increased glutathione peroxidase levels and resistance to DNA breakage V〔J〕.Mech Ageing Dev，1998;105(1-2):137-50.

14 Miles EA，Thies F，Wallace FA，et al.Influence of age and dietary fish oil on plasma soluble adhesion molecule concentrations〔J〕.Clin Sci(Lond)，2001;100(1):91-100.

15 Shelton DN，Edwin C，Whittier PS，et al.Microarray analysis of replicative senescence〔J〕.Curr Biol，1999;9:939-45.