蔣莉婭，黃繼人，趙弘卿，戴建良，張衛(wèi)東，諸靜芬

(1.無錫市第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 無錫 214002;2.無錫市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰中心，江蘇 無錫 214041;3.無錫市第二人民醫(yī)院呼吸科，江蘇 無錫 214002;4.無錫市中醫(yī)院普外科，江蘇 無錫 214001)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)易誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能不全綜合征(MODS)，病死率高。其死亡病例中有50%以上為早期合并急性肺損傷(acute injury of lungs，ALI)，可迅速惡化演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(ARDS)，從而成為SAP早期死亡的主要原因［1］。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谥嗅t(yī)“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下，針刺大鼠SAP早期ALI模型的肺、大腸及脾經(jīng)相關(guān)穴位，并通過測(cè)定其肺損傷病理評(píng)分、肺組織濕/干重、肺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表達(dá)水平，旨在進(jìn)一步明確針刺對(duì)SAP大鼠ALI的保護(hù)作用及其機(jī)制［2］。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠 40只，重量 250g±20g，購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。結(jié)晶?；悄懰徕c、CORM-2購自Sigma公司。iNOS(GenBank中編號(hào)NM_012611.3)上游引物 P1:5'-ATC CCG AAA CGC TAC ACT-3'，下游引物 P2:5'-GTC TGG CGA AGA ACA ATC-3'，擴(kuò)增片段大小為315 bp。eNOS(GenBank中編號(hào)NM_021838.2)上游引物 P1:5'-CTC ACC GAT ACA ACA TAC-3'，下游引物 P2:5'-GAG CCA TAC AGG ATA GTC-3'，擴(kuò)增片段大小為469 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(GenBank中編號(hào)NM_017008.3)上游引物 P1:5'-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3'，下游引物 P2:5'-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3'，擴(kuò)增片段大小為140 bp。以上引物均由上海英駿生物技術(shù)公司提供合成，Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海英駿生物技術(shù)公司。

1.2 動(dòng)物模型制備

40只大鼠隨機(jī)分為sham組、SAP組、針刺治療組及針刺對(duì)照組，每組10只。禁食、自由飲水12h后，1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。sham組模擬造模手術(shù)情況，開腹后僅輕度揉搓胰腺、翻轉(zhuǎn)腸管5min后即關(guān)腹;SAP組采用胰膽管逆行注入3.5%牛黃膽酸鈉(0.1ml/100g)的方法建立SAP模型［3］。針刺對(duì)照組在 SAP造模手術(shù)后0.5h，取穴肺、脾經(jīng)穴位及其背腧穴，分別為尺澤、孔最、魚際、少商、地機(jī)、三陰交、肺俞及脾俞等，針刺0.5h后起針;針刺治療組于造模0.5h后，在對(duì)照組基礎(chǔ)上，加刺大腸經(jīng)穴位及其背腧穴商陽、合谷、曲池和大腸俞，穴位定位參見《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［4］。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)

4組大鼠均于造?；蛐g(shù)后6h后處死，無菌操作下取出右肺下葉，液氮固定后置于－80℃冰箱保存，備行RT-PCR。取右肺中葉行常規(guī)病理學(xué)檢查并行病理學(xué)評(píng)分。計(jì)算左肺濕/干重比，間接反映肺水腫程度。取冷凍肺組織，用Trizol法抽提總RNA，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說明書操作步驟合成第一鏈，合成的第一鏈分裝于 －20℃保存?zhèn)溆?。采?RTPCR法測(cè)定其 iNOS及 eNOS mRNA的表達(dá)情況。上海英駿生物技術(shù)公司合成iNOS、eNOS和GAPDH引物，用ddH2O溶解，分裝于 －20℃保存?zhèn)溆?。?5μL PCR反應(yīng)體系中加入 cDNA 1μL，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s;循環(huán) 30次。最后 72℃延伸 10 min，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。電泳鑒定后用凝膠圖像掃描儀測(cè)算各條帶的光密度值，分別以iNOS、eNOS條帶與GAPDH條帶光密度值比較表示其mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件采用方差分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺臟病理學(xué)改變

(1)大體觀:sham組肺臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本正常。SAP組肺臟表面暗紅并伴有點(diǎn)片狀出血灶，水腫明顯。針刺治療組肺臟見少量出血點(diǎn)，水腫輕。針刺對(duì)照組肺臟表面有點(diǎn)片狀出血點(diǎn)，面積大小介于SAP組和針刺治療組之間，水腫程度亦介于前兩者之間;(2)光鏡檢查:sham組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，無中性粒細(xì)胞浸潤。SAP組可見肺間質(zhì)充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤;肺泡間隔明顯增厚，較多的肺泡萎縮，肺泡腔部分融合成肺大泡;毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，局灶性肺泡內(nèi)出血。針刺治療組肺組織炎癥明顯較SAP組減輕。針刺對(duì)照組光鏡結(jié)構(gòu)、肺組織炎癥及肺間質(zhì)充血、水腫程度均介于SAP組與治療組之間(圖1)。

圖1 各組肺組織病理學(xué)觀察(HE染色 ×100)

2.2 其他指標(biāo)

表1圖2顯示，針刺治療組的肺濕/干重比和病理學(xué)評(píng)分較 SAP組、針刺對(duì)照組均顯著降低(P＜0.05);與SAP組和針刺對(duì)照組相比，針刺治療組肺組織中iNOS及eNOS mRNA表達(dá)也明顯下降(P＜0.05)。

表1 各組肺組織病理評(píng)分、肺組織濕/干重比、iNOS及eNOSmRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 各組肺組織病理評(píng)分、肺組織濕/干重比、iNOS及eNOSmRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05;與 SAP組比較:#P＜0.05;與針刺對(duì)照組比較:△P＜0.05

組 別 肺濕/干重比 病理學(xué)評(píng)分iNOS mRNA eNOS mRNA Sham 組4.51 ±0.36 0 0.43 ±0.12 0.13 ±0.04針刺治療組 4.75 ±0.61#△ 5.64 ±0.460#△ 0.56 ±0.32#△ 0.24 ±0.05#△SAP 組 5.89 ±0.87* 7.95 ±1.540* 1.03 ±0.11* 0.72 ±0.06*針刺對(duì)照組 5.31 ±0.33* 6.05 ±1.024* 0.76 ±0.33* 0.45 ±0.05*

圖2 各組肺組織中iNOS和eNOS mRNA的表達(dá)水平

3 討論

SAP引起的全身炎癥反應(yīng)能導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器功能障礙，其中 ALI是患者早期死亡的主要原因。ALI的主要病理變化是彌漫性肺泡和肺泡毛細(xì)血管膜損傷，大量炎性滲出積聚在肺間質(zhì)和肺泡腔中形成充血、水腫［5］。研究發(fā)現(xiàn)，SAP器官衰竭發(fā)生率約為72% ～90.3%，其中肺臟衰竭最為常見，其次為心血管系統(tǒng)、肝臟和腎臟。因此，防治肺損傷成為降低SAP早期死亡率的重要措施。

NO是一種具有自由基性質(zhì)的生物信息分子和效應(yīng)分子，可參與體內(nèi)多種生理和病理反應(yīng)過程。生理狀態(tài)下機(jī)體一般產(chǎn)生低濃度和短暫的 NO，主要作為生物信使分子和細(xì)胞保護(hù)劑對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。而在病理狀態(tài)下，高濃度的NO可抑制三羧酸循環(huán)和DNA復(fù)制中關(guān)鍵酶的活性，造成能量代謝障礙和 DNA損傷，并增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)活性，進(jìn)而增加 TNF-α等前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷。NOS是NO的一種合成酶，有nNOS(原生型)、iNOS及eNOS 3種類型。它在生理狀態(tài)下很少表達(dá)，但在炎癥、創(chuàng)傷等情況下表達(dá)增強(qiáng)，并使NO的分泌增加。SAP時(shí)NOS誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的大量NO，對(duì)組織細(xì)胞具有損傷作用，參與機(jī)體多種疾病(如急性肺損傷、心血管失代償、消化道出血、急性腎功能衰竭、胰性腦病以及ARDS等)的發(fā)病過程。

有關(guān)“肺與大腸相表里”理論，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有記載?！鹅`樞·經(jīng)脈》:“肺手太陰之脈，起于中焦，下絡(luò)大腸……上膈屬肺?！薄按竽c手陽明之脈，絡(luò)肺下膈屬大腸”。該理論總結(jié)的宏觀規(guī)律指出，在空間和功能上不同的兩個(gè)臟腑，在生理和病理上具有密切聯(lián)系［6］。消化管、呼吸道及腺的上皮組織大多來源于原始消化管的內(nèi)胚層，這種胚胎學(xué)上的共同來源被認(rèn)為是“肺與大腸相表里”的生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胰腺炎發(fā)病多因飲食不節(jié)，損傷脾胃，釀濕生熱化毒，導(dǎo)致氣滯血瘀，濕熱壅結(jié)，水熱互結(jié)，陽明腑實(shí)。孫思邈《千金要方》中有以下記載:“脾重二斤三兩，扁廣三寸，長(zhǎng)五寸，有散膏半斤……凡脾臟像土，與胃合為腑?！备鶕?jù)上述文獻(xiàn)記載，本實(shí)驗(yàn)組更傾向于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的“胰”接近于古代醫(yī)學(xué)中“脾”的觀點(diǎn)。

經(jīng)驗(yàn)表明，單一或聯(lián)合運(yùn)用通里攻下、活血化瘀及清熱解毒湯劑口服、灌胃或保留灌腸等，均能在SAP早期有效地保護(hù)胰腺及減輕胰外器官的損傷。針灸的調(diào)節(jié)效應(yīng)具有即時(shí)和多器官性。本實(shí)驗(yàn)中，針刺治療組選擇針刺SAP大鼠肺經(jīng)的尺澤、孔最、魚際和少商，能清熱解毒保肺，抑制肺組織中性粒細(xì)胞的大量浸潤;大腸經(jīng)的商陽、合谷和曲池，能促進(jìn)胃腸道的排空，通里攻下，減少腸道細(xì)菌易位;胰腺在十四經(jīng)中無完全對(duì)應(yīng)的經(jīng)脈，可選擇脾經(jīng)代替，地機(jī)為脾經(jīng)“郄穴”，郄主急，故治療急性重癥胰腺炎有奇效。三陰交為足三陰經(jīng)之會(huì)，“脾俞”為脾經(jīng)背腧穴，脾統(tǒng)血，上述脾經(jīng)三穴活血化瘀、引血下行。諸穴合用，共奏清胰保肺之功［2］。

本實(shí)驗(yàn)中，SAP導(dǎo)致肺組織病理學(xué)評(píng)分、肺組織濕/干重比明顯升高，而針刺治療組則顯著降低了上述指標(biāo)，說明針刺可以有效減輕SAP并發(fā)的ALI，針刺治療組上述指標(biāo)低于對(duì)照組，進(jìn)一步說明在“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下的針刺治療組效果更為明顯。為探討其機(jī)制，我們通過檢測(cè)針刺對(duì)SAP大鼠肺組織中iNOS和eNOS mRNA的表達(dá)水平，探討內(nèi)源性NOS在肺損傷中的作用。結(jié)果顯示，在SAP造模后6h后，針刺治療組肺組織iNOS、eNOS mRNA表達(dá)量均高于sham組，而低于SAP組和針刺對(duì)照組，這表明iNOS和eNOS mRNA的過量表達(dá)可能在SAP肺損傷中起重要作用，分析其原因可能是由于SAP時(shí)血循環(huán)來源的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子以及一些具有催化活性的酶等因素均能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo) iNOS和 eNOS mRNA表達(dá)增加，催化產(chǎn)生大量的 NO，NO能強(qiáng)烈擴(kuò)張肺毛細(xì)血管，增加血管通透性和蛋白溢出，造成肺組織低灌注、血流瘀滯、局部炎癥反應(yīng)和通氣/血流比值失調(diào)，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、充血等一系列病理生理過程。

研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞活化可能是急性胰腺炎肺損傷的重要途徑。肺泡巨噬細(xì)胞活化后可產(chǎn)生許多活性介質(zhì)，如NO、TNF-α、花生四烯酸等代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)均為前炎癥介質(zhì)，可引起炎性細(xì)胞聚集并浸潤入肺，引起肺損傷。本課題的以往研究［2］提示，針刺能顯著減輕SAP時(shí)肺組織損傷，其機(jī)制與抑制巨噬細(xì)胞功能、抑制肺泡巨噬細(xì)胞分泌 TNF-α和下調(diào)NO水平有關(guān)。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而得出結(jié)論:在“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下的針刺治療，能顯著減輕SAP早期肺組織損傷，其機(jī)制可能與抑制肺泡巨噬細(xì)胞iNOS和eNOS mRNA過量表達(dá)，從而顯著下調(diào)NO水平有關(guān)。而明確其機(jī)制，從而深入闡釋“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下針刺對(duì)SAP大鼠早期肺損傷的保護(hù)作用，仍有待于進(jìn)一步的研究。

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